利用过表达hoxa10基因制备转基因猪的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于猪转基因技术领域，具体涉及一种利用过表达H0XA10基因制备转基 因猪的方法。
【背景技术】
[0002] 养猪业是畜牧业生产体系的重要组成部分，在畜牧行业中占有举足轻重的地位。 对于养猪生产者来说，猪繁殖性状特别是产仔数是影响生产效益的重要因素之一。但由于 产仔数性状受到受精率、排卵率、胚胎着床等多种因素的影响，同时还是低遗传力性状，遗 传力仅为0. 10-0. 15,通过传统的选育方法进行改良，进展缓慢、收效甚微。虽然产仔数遗传 改良难度大，但因其经济效益高，开发利用新的遗传改良技术尤为重要。
[0003] 从上世纪80年代起，转基因技术发展迅速。在生物育种方面，相对于传统技术， 使用转基因技术可使育种年限大大缩短。因此，转基因技术为提高母猪繁殖性能与遗传改 良提供了新思路以及新途径。但在利用转基因技术提高母猪繁殖数性能的过程中，选择影 响母猪繁殖性能的主效基因是最为关键的一环，因此对所选基因的功能鉴定则显得十分重 要。
[0004] 在人与小鼠中，同源异形框基因H0XA10 (HomoboxlO)已被多次报道与子 宫内膜容受性（TaylorHSetal.，HOXgeneexpressionisalteredinthe endometriumofwomenwithendometriosis.Hum.Reprod1999,14(5):1328-1331 ； BagotCNetal.,:MaternalHoxalOisrequiredforpinopodformationin thedevelopmentofmouseuterinereceptivitytoembryoimplantation. DevelopmentalDynamics2001，222，（3) :538-544)、胚胎附植(TaylorHS:Therole ofHOXgenesinhumanimplantation.Hum.Reprod, 2000, 6(1) :75-79：HyuniungLim etal. ,Hoxa-10RegulatesUterineStromalCellResponsivenesstoProgesterone duringImplantationandDecidualizationintheMouse.MolecularEndocrinology June1999, 13 (6): 1005-1017)和胚胎发育（LeoFetal.，：Regulationoftryptophan 2,3-dioxygenasebyHOXA10enhancesembryoviabilitythroughserotonin signaling.EndocrinologyandMetabolim2011，300(1) :86_93)等繁殖性状相关D 本 实验室对该基因的部分功能进行了相关研究，发现H0XA10基因在猪（Genebank登录号为 JN836599)与人（GenBank登录号为NM_018951)和小鼠（GenBank登录号为NM_008263)中 高度保守，并且猪H0XA10基因的表达与母猪子宫内膜的功能相关；同时通过孕激素处理 妊娠小鼠，发现H0XA10基因表达量上调时，小鼠的胚胎着床数上升，验证了H0XA10基因对 胎附植具有重要作用（WuDetal. ,Molecularcharacterizationandidentification oftheE2/P4responseelementintheporcineHOXAlOgene.MolCellBiochem 2013, 374:213-222)。因而，猪H0XA10作为与繁殖性状密切相关的候选基因，构建转H0XA10 基因猪模型，从个体水平上进一步研究其作用机理并用于提高猪繁殖性能显得十分必要。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种利用过表达H0XA10基因制备 转基猪的方法。本发明以猪H0XA10基因为研宄对象，基于传统克隆技术，利用本实验前期 构建的雌激素诱导型启动子载体质粒pc3. 1-H0XA10-DNA转染大白猪胎儿成纤维细胞，通 过G418筛选，PCR鉴定转H0XA10基因细胞系，然后将所建立的PCR阳性转H0XA10基因细胞 系用于手工核移植，共移植5头受体母猪，其中3头受孕，最后通过PCR、RT-PCR、染色体步 移技术检测H0XA10基因的表达证实获得H0XA10的转基因克隆猪。该转基因猪可用于研宄 H0XA10对母猪繁殖性能的影响并提供动物模型，以及培育具有高繁殖性能的优良品种猪。
[0006] 本发明的技术方案如下所述：
[0007] 1、构建稳定表达H0XA10基因的猪成纤维细胞系：
[0008] 1. 1线性化pc3. 1-H0XA10-DNA载体：将本申请人所在的华中农业大学动物遗传育 种与繁殖实验室前期已构建的pc3. 1-H0XA10-DNA质粒（见序列表SEQIDNO:l、图1)DNA 采用Bglll单酶切进行线性化处理。
[0009] 1. 2建立大白猪胎儿成纤维细胞系：采用胰酶消化法消化33日龄的大白猪胎儿， 分离得到的大白猪胎儿成纤维细胞置于细胞液中在38. 5°C、5%C02、100%湿度的培养箱中 进行传代培养。
[0010] 1.3建立转H0XA10基因细胞系：利用Y染色体特异基因SRY序列（Genebank 登录号：U49860)设计引物来鉴定大白猪胎儿成纤维细胞的性别，根据实验需求选取不 同性别的大白猪胎儿成纤维细胞作为受体细胞，利用Invitrogen公司生产的脂质体 Lipofectamine?2000(货号：11668-019)将pc3. 1-H0XA10-DNA质粒转染入受体细胞。转 染24小时后利用800yg/mlG418进行筛选。连续筛选7-8天后将G418浓度逐渐降低至 200yg/ml并维持培养，最终获得抗性单克隆细胞并扩大培养。随后通过PCR对获得的单克 隆细胞进行鉴定，得到转H0XA10基因的阳性细胞，用于后续实验。
[0011] 2、转H0XA10基因克隆胚胎的制备
[0012] 2. 1猪卵母细胞体外成熟培养：从屠宰场收集猪的卵巢置于37°C生理盐水中，2小 时内运回实验室。采用带有18号针头的10ml-次性注射器采集3-6_卵泡中的卵泡液并 放入15ml离心管中，静止10分钟后弃去上清，用采卵液（名称PVA-TL-HEPES，配方：称取聚 乙烯醇 0?lg，NaCl6. 6633g，KCl0? 2386g，NaH2P040. 0408g，NaHC030. 168g，羟乙基哌嗪乙硫 磺酸Ifepes2. 383g，酚红0. 0022g，山梨醣醇2. 186g，丙酮酸钠0. 022g，乳酸钠1. 868ml，青 霉素GO. 065g，硫酸链霉素 0? 025g，MgCl2 ? 6H20 0? 1017g，CaCl2 ? 2H200. 294g，用双蒸水定 容至100ml，并将pH调至7. 4)洗两遍。在显微镜下挑选形态规则，细胞质均匀，外围有3-5 层卵丘细胞紧密包裹的卵丘细胞-卵母细胞复合体（简称COCs)置于38. 5°C、5%C02、饱和 湿度的培养箱中培养42-44小时，随后用透明质酸酶消化，吹打成裸卵，以第一极体排出为 猪卵母细胞成熟的标准。猪卵母细胞成熟培养液配方：基础培养液为培养基Mediuml99(购 自Gibco公司），在其中添加10% (体积比）猪卵泡液（PFF)，0? 1%聚乙烯醇（PVA，）30mM NaHC03,10yg/ml庆大霉素（Gentamicin)，3. 05mMD-葡萄糖（D-Glucose)，0? 91mM丙酬酸 钠（Na-pyruvate)，0? 07g/LL-胱氨酸盐酸盐（L-cystine)，12. 5ng/ml表皮生长因子（EGF lOIU/ml促黄体生成素（LH)，lOIU/ml促卵泡生成素（FSH)。
[0013] 2. 2卵母细胞去核与移核：按照Lai等人报道的方法（LaiLX，Prather RS:ProductionofClonedPigsbyUsingSomaticCellsasDonors.Clonedandstem cells2003, 5(4) :233-2405)，将猪的卵母细胞置于显微操作盘工作滴中，随后将固定针 (Holder)固定住卵母细胞，注射针（injection)针尖快速刺破透明带后收针，轻柔地破开 细胞膜，然后缓慢回针，使针口正对极体且位于透明带间隙内，缓缓吸取1/5-1/4的细胞质 并同时吸走极体，沿横轴方向快速出针，迅速推动油压泵，使吸取物顺着透明带涌出。利用 胰酶将用于移核的细胞消化并置于显微操作盘中，将显微操作针调节到最佳位置，选取中 等大小、活力较好的细胞约30-50个吸入injection中。Holder固定胚胎后，调节焦距， 使胚胎与injection在同一平面，稍微给injection-点向外打细胞的力，待细胞将要出 injection