到2-4细胞期后，挑选形态和发育较好的胚胎进行移植。自然发 情第0d或第Id的二元后备母猪（大白猪X长白猪）、8月龄、体重100kg)作为受体（以出 现压背静立反射为发情的第〇d)。移植方法为手术法输卵管深部移植其输卵管壶腹部-峡 部结合处。每头受体移植约250枚胚胎。在本实施例中转H0XA10基因的2号细胞系移植给 2头母猪，转H0XA10基因的3号细胞系移植给3头母猪。胚胎移植后35d、70d进行B超妊娠 检测，移植的5头受体母猪最终有3头受孕，共获得8头活仔，其中3头小猪来自转H0XA10 基因的2号细胞系（编号2-1、2-2、2-3)，5头小猪来自转11(?410基因的3号细胞系（编号 3-1、3-2、3-3、3-4、3-5) 〇
[0065] 步骤6.转基因猪分子生物学鉴定
[0066] 6. 1PCR检测
[0067] 小猪出生饲养至断奶后，提取产下的8头小猪尾组织及耳组织样，以基因组DNA为 模板，野生（即非转基因）大白猪基因组DNA为阴性对照，pc3. 1-H0XA10-DNA质粒为阳性对 照，采用鉴定转H0XA10基因成纤维细胞系的三对特异性引物进行扩增：pc3. 1-H0XA10-DNA 重组载体中跨部分pcDNA3.lplus载体序列与部分H0XA10基因启动子序列的特异性 引物KZQ-F:5' -TTGGAGGTCGCTGAGTAGT-3'，KZQ-R:5' -CCGAGGCTATGACAAGAAC-3'、 跨H0XA10基因部分DNA序列与pcDNA3.lplus部分载体序列的特异性引物KDZ-F: 5' -TTCTCCTCCCTCTGTCATC-3'，KDZ-R:5' -CACCCCCCAGAATAGAATG-3'、pcDNA3. 1 部分载体序 列的特异性引物ZT-F:5' -TCTGATGCCGCCGTGITC-3'，ZT-R:5' -TACGTGCTCGCTCGATGC-3'，将 测序得到的序列与载体pc3. 1-H0XA10-DNA序列（见序列表SEQIDNO1)进行比对，验证 PCR产物的真实性。三对引物均能扩增出且扩增片段为正确片段（KZQ-F/R、KDZ-F/R、ZT-F/ R对应的扩增序列分别见序列表SEQIDNO:2,SEQIDNO:3,SEQIDNO:4)，证实转基因猪 的H0XA10基因已经成功整合到基因组中。图5为8头转基因猪的PCR检测结果。结果显 示8头转基因小猪均能被上述三对特异性引物扩增出特异性片段，而水和野生（非转基因） 大白猪均不能扩增出片段，表明8头转基因小猪PCR检测为阳性。
[0068] 6. 2Real_timePCR检测
[0069] 采用20ylPCR的反应体系，包含DNAl.Oyl，SYBRIMix10yl，正、反向引 物（见序列表SEQIDN08、10)各0.3yM，其余用灭菌水补足。反应体系在LightCyder? 480Multiwellplate96中混勾并用封板膜封口。反应程序为95°C3min，40个循环， 94°C20s，60°C30s，72°C15s，最后做溶解曲线从55°C-90°C每分钟上升0. 5°C。所有的样 品都在同一 96孔板中做三次重复，数值以mean土sd表不。
[0070] 将含外源基因的质粒pc3. 1-H0XA10-DNA与野生型大白猪胎儿成纤维细胞基因组 DNA混合，设置含有10°个、10 1个、10 2个、10 3个和10 4个外源基因拷贝数的标准品对照，具 体如下：假设野生型猪基因组DNA用量为ang;含有外源基因基因片段的质粒大小为bbp; 单倍体猪基因组DNA大小为3X109bp;外源基因片段完全随机的头尾相连（或头头相连） 插入一条染色体上，那么ang的转基因阳性猪基因组DNA
【主权项】
1. 一种利用过表达H0XA10基因制备转基因猪的方法，其特征在于下列步骤： (1) 线性化pc3. 1-H0XA10-DNA载体：将已雌激素诱导型H0XA10基因表达载体 pc3. 1-H0XA10-DNA载体用Bglll进行单酶切线性化处理，分离纯化得到线性表达盒片段， 该表达盒片段的核苷酸序列如SEQ ID N01所示； (2) 构建大白猪胎儿成纤维细胞系：采用胰酶消化法消化33日龄的大白猪胎儿，分离 得到的大白猪胎儿成纤维细胞置于细胞液中，在38. 5°C、5% C02、100%湿度的培养箱中进 行传代培养； (3) 脂质体转染及细胞筛选：利用脂质体将H0XA10基因表达载体转染入受体细胞，采 用800 y g/mlG418连续筛选7-8天后，将G418浓度逐渐降低至200 y g/ml并维持培养，最 终获得抗性单克隆细胞并扩大培养，随后通过PCR对获得的单克隆细胞进行鉴定，得到表 达插入的H0XA10基因的阳性细胞； (4) 利用人工克隆方法获得重组胚胎： 1) 卵母细胞的制备：从屠宰场收集的猪的卵巢置于37°C生理盐水中，2小时内运回实 验室，采用带有18号针头的10ml -次性注射器采集3-6mm卵泡中的卵泡液，将采集好的 卵泡液放入15ml离心管中，静止10分钟后弃去上清，用采卵液清洗两遍，在显微镜下挑选 形态规则，细胞质均匀，外围有3-5层卵丘细胞紧密包裹的卵丘细胞-卵母细胞复合体置于 38. 5°C、5% C02、饱和湿度的培养箱中培养42-44小时后用透明质酸酶消化，吹打成裸卵，以 第一极体排出为卵母细胞成熟的标准； 2) 构建重构胚胎：将成熟的卵母细胞置于显微操作盘工作滴中，随后将固定针固定住 卵母细胞，将注射针针口正对极体且位于透明带间隙内，缓缓吸取1/5-1/4的细胞质并同 时吸走极体，去除卵母细胞的细胞核，然后选取中等大小、活力较好的细胞注入卵母细胞卵 周隙，最后采用电融合的方法形成重构胚胎，融合电击参数为1. 3kv/mm、30us、2次脉冲， 30min后观察融合率，未融合的进行二次融合，将融合后的卵母细胞放入38°C、5% C02中培 养，48h后观察卵裂率，6d后观察囊胚发育情况； 3) 胚胎移植：当重组胚胎体发育至2-4细胞期后，挑选形态和发育较好的胚胎进行移 植，每头受体移植约250枚胚胎，共移植5头母猪，胚胎移植后35天、70天时进行B超妊娠 检测； 4) 转基因猪的鉴定：小猪出生后采取耳朵与尾部组织提取基因组DNA，以此为模板进 行PCR、Real-time PCR和染色体步移方法来鉴定其阳性。
2. 如权利要求1所述的利用过表达H0XA10基因制备转基猪的方法，其特征在于：所述 的步骤（4)中的步骤3)与步骤4)中PCR鉴定是通过以下三对引物进行扩增：KZQ-F/R，如 序列表SEQ ID NO 2所示；KDZ-F/-R，如序列表SEQ ID NO 4所示；ZT-F/R，如序列表SEQ ID NO 6所示，扩增产物在1. 5%琼脂糖凝胶上进行电泳检测。
3. 如权利要求1所述的利用过表达H0XA10基因制备转基因猪的方法，其特征在于：步 骤⑷中的步骤4)中所述的Real-time PCR检测，是通过插入载体检测引物ZT1-F/R(如 序列表SEQ ID NO 8所示）和内参基因转铁蛋白受体检测引物TFRC-F/TFRC-R(如序列表 SEQ ID NO 10所示）扩增来校正外源H0XA10基因插入的拷贝数。
4. 如权利要求1所述的利用过表达H0XA10基因制备转基因猪的方法，其特征在于：步 骤（4)中的步骤4)中所述的染色体步移方法是通过三条随机引物与三条特异性引物： SP1:5-TTGATTCCGTTAGGACGTTTGCCTAC-3， SP2:5-GACTGACAACTTTGGCTGAAAGACTC-3, SP3:5-TCGAGGAAGTGAAAGAAACATCGGT-3) 进行热不对称PCR扩增，从而得到已知序列侧翼的未知序列，进而得到外源H0XA10基 因的插入位点。
5.如权利要求1-4任一项所述的方法在制备转基因猪遗传操作中的应用。
【专利摘要】本发明属于猪的转基因技术领域，具体涉及一种利用过表达HOXA10基因制备转基因猪的方法。本发明的特征在于，将构建的HOXA10基因表达载体通过脂质体转染和硫酸盐(G418)筛选得到稳定表达的转HOXA10基因的细胞系；以转HOXA10基因的猪成纤维细胞为核供体通过人工核移植的方法移入去核的猪的卵母细胞中形成重构胚；将重构胚胎移植入受体母猪输卵管中，待母猪生产获得转HOXA10基因猪并进行分子鉴定，筛选出阳性转HOXA10基因猪。本发明的转基因猪不仅为研究HOXA10基因提高繁殖力的机理提供素材，也为揭示猪HOXA10基因其他功能提供了动物模型。
【IPC分类】C12N15-85, A01K67-027, C12N15-873
【公开号】CN104531763
【申请号】CN201410855615
【发明人】赵书红, 肖倩, 赵长志, 林瑞意, 经璐, 李新云, 李长春, 余梅, 成宏
【申请人】华中农业大学
【公开日】2015年4月22日
【申请日】2014年12月30日