肺炎克雷伯氏菌的鉴定方法及所用引物的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种肺炎克雷伯氏菌的鉴定方法及所用引物，属于生物技术领域。
【背景技术】
[0002]肺炎克雷伯氏菌(K.pnenmoniae)是一种G-杆菌,属于肠杆菌科,条件性致病菌。肺炎克雷伯氏菌与大肠杆菌在普通的营养琼脂、麦康凯琼脂等培养基上具有极高的相似性，细菌的形态、颜色、气味都很相近，革兰氏染色镜捡中都是短小的G-小杆菌。在常规的细菌培养中很难将肺炎克雷伯氏菌和大肠杆菌区别开来，而做细菌的生化鉴定和16sRNA鉴定需要比较长的时间，约3-4天的时间。如果做16sRNA鉴定还需要进行测序，成本比较高。而荧光实时定量聚合酶链式反应(real time PCR)技术虽然简化了操作过程，缩短了检测的时间，但却需要更复杂的定量测定仪器，一般的实验室不配备。另外，毛皮动物克雷伯氏菌病以支气管炎、肺炎，败血症，脑膜炎，腹膜炎，腹泻等为主要症状；与绿脓杆菌也引起的肺炎的症状相同。每年绿脓杆菌和肺炎克雷伯氏菌引发的水貂肺炎不计其数，在兽医临床中十分常见。可见更加快速的将肺炎克雷伯氏菌与大肠杆菌、绿脓杆菌区分开是十分重要的。所以，目前急需要一种比较简单可行的实验室检测的方法将肺炎克雷伯氏菌与大肠杆菌、绿脓杆菌区分开来。
【发明内容】
[0003]本发明通过创造劳动获取了两对引物(人工合成基因序列)，采用该引物对肺炎克雷伯氏菌、大肠杆菌和绿脓杆菌进行PCR扩增，扩增产物为肺炎克雷伯氏菌的特异性序列；从而能够将肺炎克雷伯氏菌与大肠杆菌和绿脓杆菌区分开。
[0004]本发明的目的之一在于提供一种用于PCR扩增、能将肺炎克雷伯氏菌与大肠杆菌、绿脓杆菌区分开的引物。
[0005]一种用于鉴定肺炎克雷伯氏菌的引物，包含引物对Kl或/和引物对K2 ；
其中，Kl包括Kl-F和Kl-R，K2包括K2-F和K2-R ；
所述Kl-F、Kl-R、K2-F、K2-R的核苷酸序列分别为序列表中的SEQ ID N0.1、SEQ IDN0.2, SEQ ID N0.3, SEQ ID N0.4。
[0006]Kl-F 为:5- CGATGCTACTTATCCCGACA- 3，如 SEQ ID N0.1 所示，
Kl-R 为:5- ACCACCAGCAGACGAACTT- 3，如 SEQ ID N0.2 所示；
K2-F 为:5- CGGAGCGTTTTTCAATCGG- 3，如 SEQ ID N0.3 所示，
K2-R 为:5- TGAGCGGGTAATAAATGCGG- 3，如 SEQ ID N0.4 所示。
[0007]所述引物对Kl和所述引物对K2可独立包装，也可混合之后包装。
[0008]用上述引物对待测样品进行PCR扩增，得到、且唯一得到大小为303bp的PCR扩增产物，测序结果如SEQ ID N0.5所示。经研究比对发现，扩增产物为肺炎克雷伯氏菌溶血蛋白基因序列中的其中一段。虽然，溶血蛋白基因序列通常不具备特异性，但是将本发明的扩增产物与大肠杆菌、绿脓杆菌的基因序列对比发现，扩增产物相对于大肠杆菌、绿脓杆菌的基因序列具备特异性，能够将肺炎克雷伯氏菌与大肠杆菌、绿脓杆菌区分开。
[0009]本发明的第二个目的是提供一种能将肺炎克雷伯氏菌与大肠杆菌、绿脓杆菌区分开的检测试剂。
[0010]本发明的检测试剂，包含上述引物；还包含PCR试剂。
[0011]所述PCR试剂是指在聚合酶链式反应中所用的dNTP、Taq DNA聚合酶、MgCljP PCR反应缓冲液等。
[0012]肺炎克雷伯氏菌的鉴定方法，用上述引物或检测试剂对待测样品进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；用琼脂糖凝胶电泳或测序法检测PCR扩增产物。
[0013]具体的为:取4yL待测样品、4yL引物对Kl或/和引物对K2(上下引物各2yL)和25 μ L PCR试剂，用灭菌双蒸水补充至50 μ L ;第一步，94°C预变性5min ;第二步，94°C变性30s ;第三步，58°C退火30s ;第四步，72°C延伸Imin ;第二步到第四步共进行35个循环；第五步，72°C终延伸7min，得PCR扩增产物；取5ul扩增产物经1.5% (W/V)琼脂糖凝胶电泳，电泳结果在B1-RAD紫外凝胶成像系统上照相。如果在300bp左右出现清晰的条带，则说明待测样品中含有肺炎克雷伯氏菌。
[0014]本方法用于非诊断和治疗目的。
[0015]有益效果
本发明的引物，相对于大肠杆菌、绿脓杆菌的基因序列的特异性强，能够将肺炎克雷伯氏菌与大肠杆菌、绿脓杆菌区分开；
本发明引物在用于鉴定是否存在肺炎克雷伯氏菌时，灵敏度高，所能检测到肺炎克雷伯氏菌的最低浓度为0.0OOlMcf ；
本发明的鉴定方法，从PCR扩增开始到琼脂糖凝胶电泳，时间大约为3个小时，大大节省了时间，并且试验步骤简单易操作，提高了检测效率。
【附图说明】
[0016]图1，本发明引物对肺炎克雷伯菌PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图；图中，M =DNAmaker DL2000,1-7泳道和9_15泳道为肺炎克雷伯氏菌的扩增产物，8和16泳道为阴性对照；1_8泳道第一对引物，9-16泳道第二对引物；
图2，本发明引物对大肠杆菌PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图；图中，Ml, M2 =DNAmaker DL2000 ；1-10泳道和12-21泳道为10株大肠杆菌的扩增产物；11和22泳道为阴性对照；1_11泳道是第一对引物；2_22泳道是第二对引物；
图3，本发明引物对绿脓杆菌PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图；图中，Ml, M2 =DNAmaker DL2000 ；1-10泳道和12-21泳道为10株大肠杆菌的扩增产物；11和22泳道为阴性对照；1_11泳道是第一对引物；2_22泳道是第二对引物；
图4，本发明引物对肺炎克雷伯菌、大肠杆菌和绿脓杆菌混合菌液的PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图；图中，M:DNA maker DL2000 ;1_3泳道为第一对引物检测肺炎克雷伯氏菌、大肠杆菌、绿脓杆菌三种混合菌液的结果；4_6泳道为第一对引物检测肺炎克雷伯氏菌、绿脓杆菌两种混合菌液的结果；7_9泳道为第一对引物检测肺炎克雷伯氏菌、大肠杆菌两种混合菌液的结果；10泳道为阳性对照，检测肺炎克雷伯氏菌的结果；11泳道为阴性对照；12-14泳道为第二对引物检测肺炎克雷伯氏菌、大肠杆菌、绿脓杆菌三种混合菌液的结果；15-17泳道为第二对引物检测肺炎克雷伯氏菌、绿脓杆菌两种混合菌液的结果；18-20泳道为第二对引物检测肺炎克雷伯氏菌、大肠杆菌两种混合菌液的结果；21泳道为阳性对照，检测肺炎克雷伯氏菌的结果；22泳道为阴性对照；
图5，引物对肺炎克雷伯菌(单个菌落)的敏感性试验结果；图中，M: DNA makerDL2000,1-7泳道、9-15泳道为肺炎克雷伯，大小为300bp，8和16泳道为阴性对照。1_8泳道第一对引物，9-16泳道第二对引物；
图6，引物对Kl对肺炎克雷伯菌的敏感性试验结果；图中，M:DNA maker DL2000，1、2泳道菌液模版浓度为0.002Mcf, 3、4泳道菌液模版浓度为0.0OlMcf，5、6泳道菌液模版浓度为0.0OOlMcf，7泳道菌液模版浓度为0.1Mcf作为阳性对照，8泳道为阴性对照；
图7，引物对K2对肺炎克雷伯菌的敏感性试验结果；图中，M:DNA maker DL2000，1、2泳道菌液模版浓度为0.002Mcf, 3、4泳道菌液模版浓度为0.0OlMcf，5、6泳道菌液模版浓度为0.0OOlMcf，7泳道菌液模版浓度为0.1Mcf作为阳性对照，8泳道为阴性对照；
图1-7中，M泳道，从上至下条带的长度分别为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、10bp ;阴性对照指的是模版为蒸馏水。
【具体实施方式】
[0017]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0018]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
[0019]下述实施例中，本实验室保存的七株肺炎克雷伯菌(K.pnenmoniae),记载于2012年I月至2014年7月从发病的毛皮动物(主要是水貂)中分离得到的；现保存在