山东省动物疫病预防与控制中心。
[0020]本实验室保存的10株大肠杆菌(E.coli)，记载于2012年I月至2014年7月从发病的毛皮动物(主要是水貂)中分离得到的；现保存在山东省动物疫病预防与控制中心。
[0021]本实验室保存的10株绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa),记载于2012年I月至2014年7月从发病的毛皮动物(主要是水貂)中分离得到的；现保存在山东省动物疫病预防与控制中心。
[0022]实施例1
人工合成引物对K1、K2 ；
Kl:
Kl-F 为:5- CGATGCTACTTATCCCGACA- 3，如 SEQ ID N0.1 所示，
Kl-R 为:5-ACCACCAGCAGACGAACTT- 3，如 SEQ ID N0.2 所示；
K2:
K2-F 为:5- CGGAGCGTTTTTCAATCGG- 3，如 SEQ ID N0.3 所示，
K2-R 为:5-TGAGCGGGTAATAAATGCGG-3，如 SEQ ID N0.4 所示。
[0023]实施例2
将肺炎克雷伯菌复苏于普通营养琼脂上，挑单个菌落，摇菌过夜，将菌液当作模版进行PCR 反应。PCR 反应体系:2XTaq PCR MasterMix 25 μ L，K1-F 和 Kl-R (上下引物)各 2μ L(或者K2-F和K2-R各2 μ L )，用菌液做模版4 μ L，最后用灭菌双蒸水补充至50 μ L。反应条件为:第一步，在94°C的温度条件下预变性5min ;第二步，在94°C的温度条件下变性30s ；第三步，在58°C的温度条件下退火30s ;第四步，在72°C的温度条件下延伸Imin ;第二步到第四步共进行35个循环；第五步:在72°C的温度条件下终延伸7min;PCR扩增结束。对扩增产物测序，其序列均SEQ ID N0.5所示，为肺炎克雷伯氏菌的特异性基因序列。可见，该引物能将肺炎克雷伯氏菌检测到。其中，2XTaq PCR MasterMix ;包含Taq DNA聚合酶、(1见1^、1%(:12、反应缓冲液、？0?反应的增强剂和优化剂以及稳定剂，浓度为2\ ;购于天根生化科技(北京)有限公司，产品目录号为KT201。
[0024]重复性试验:
对肺炎克雷伯氏菌的特异性试验
将本实验室保存的7株肺炎克雷伯氏菌分别采用实施例2方法进行PCR扩增反应(PCR反应的模版为单个菌落)。PCR扩增反应结束后，分别取5ul PCR扩增产物经1.5% (W/V)琼脂糖凝胶电泳，电泳结果在B1-RAD紫外凝胶成像系统上照相；结果如图1所示，在303bp处均出现清晰条带。对扩增产物测序，其序列均如SEQ ID N0.5所示，为肺炎克雷伯氏菌的特异性基因序列。可见，该引物能将肺炎克雷伯氏菌检测到。
[0025]实施例3
对大肠杆菌的特异性试验
将本实验室保存的10株大肠杆菌分别采用实施例2的方法进行PCR扩增反应(PCR的模版为单个菌落)。PCR扩增反应结束后，分别取5ul PCR扩增产物经1.5% (W/V)琼脂糖凝胶电泳，电泳结果在B1-RAD紫外凝胶成像系统上照相；结果如图2所示，在303bp处没有出现条带。可见，该引物不能将大肠杆菌检测到。
[0026]实施例4
对绿脓杆菌的特异性试验
将本实验室保存的10株大肠杆菌分别采用实施例2的方法进行PCR扩增反应(PCR的模版为单个菌落)。PCR扩增反应结束后，分别取5ul PCR扩增产物经1.5% (W/V)琼脂糖凝胶电泳，电泳结果在B1-RAD紫外凝胶成像系统上照相；结果如图3所示，在303bp处均没有出现条带。可见，该引物不能将绿脓杆菌检测到。
[0027]实施例5
将本实验室保存的肺炎克雷伯氏菌(一株)、大肠杆菌(一株)和大肠杆菌(一株)分别复苏于普通营养琼脂上，挑单个菌落，摇菌过夜。将三种菌液混合、任意两种菌液混合之后当作模版，采用实施例2的方法进行PCR扩增反应。PCR扩增反应结束后，取5ul PCR扩增产物经1.5% (W/V)琼脂糖凝胶电泳，电泳结果在B1-RAD紫外凝胶成像系统上照相；结果如图4所不。另外的6株肺炎克雷伯氏菌中的任意一株、与另外9株大肠杆菌中的任意一株和9株大肠杆菌，采用上述方式混合后当作模版，采用实施例2的方法进行PCR扩增反应。PCR扩增反应结束后，取5ul PCR扩增产物经1.5% (W/V)琼脂糖凝胶电泳，电泳结果在B1-RAD紫外凝胶成像系统上照相；结果与图4相同。可见，此两对引物对肺炎克雷伯氏菌具有良好的特异性，能够将肺炎克雷伯氏菌与混淆程度很大的大肠杆菌和绿脓杆菌区分开。
[0028]实施例6 敏感性试验:
(I)将肺炎克雷伯氏菌7株划在普通营养琼脂上，取单个菌落作PCR反应的模版，其他反应体系不变，最后用灭菌双蒸水补充至50 μ L。反应条件同重复性试验和特异性试验。可见，单个菌落就可以用该引物检测到，说明此引物敏感性良好。结果如图5 ；
(2)取培养了 12小时的肺炎克雷伯氏菌的单个菌落，于3ml 85%Nacl生理盐水中，将菌液浓度(麦式浓度)调整为0.1 Mcf,并在此基础上进行50倍，100倍，1000倍稀释，即稀释后的菌液浓度为0.002Mcf,0.0OlMcf, 0.0OOlMcf。各取其4ul做PCR反应的模版。其他PCR反应条件及反应体系同实施例2。其中，引物对Kl的敏感性试验结果如图6所示、引物对K2的敏感性试验结果如图7所示。可见，当菌液浓度为0.0OOlMcf时仍可见清晰的条带，说明该引物的敏感性较高。
【主权项】
1.一种用于鉴定肺炎克雷伯氏菌的引物，其特征在于，包含引物对Kl或/和引物对K2 ； 其中，Kl包括Kl-F和Kl-R, K2包括K2-F和K2-R ； 所述Kl-F、Kl-R、K2-F、K2-R的核苷酸序列分别为序列表中的SEQ ID N0.1、SEQ IDN0.2, SEQ ID N0.3, SEQ ID N0.4。
2.一种用于鉴定肺炎克雷伯氏菌的检测试剂，其特征在于，包含引物对Kl或/和引物对K2。
3.根据权利要求2所述的检测试剂，其特征在于，还包含PCR试剂。
4.根据权利要求3所述的检测试剂，其特征在于，所述PCR试剂包含聚合酶链式反应中所用的dNTP、Taq DNA聚合酶、MgCljP PCR反应缓冲液。
5.一种肺炎克雷伯氏菌的鉴定方法，其特征在于，用权利要求1所述的引物或权利要求2、3或4的检测试剂对待测样品进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；用琼脂糖凝胶电泳或测序法检测PCR扩增产物。
6.根据权利要求5所述的鉴定方法，其特征在于，取4μ L待测样品、4 μ L引物对Kl或/和引物对Κ2和25 μ L PCR试剂，用灭菌双蒸水补充至50 μ L ;第一步，94°C预变性5min ；第二步，94°C变性30s ;第三步，58°C退火30s ;第四步，72°C延伸Imin ;第二步到第四步共进行35个循环；第五步，72°C终延伸7min，得PCR扩增产物；取5ul扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳，电泳结果在B1-RAD紫外凝胶成像系统上照相。
【专利摘要】本发明涉及一种肺炎克雷伯氏菌的鉴定方法及所用引物，属于生物技术领域。本发明通过创造劳动获取了两对引物（人工合成基因序列），采用该引物对肺炎克雷伯氏菌、大肠杆菌和绿脓杆菌进行PCR扩增，扩增产物为肺炎克雷伯氏菌的特异性序列；从而能够将肺炎克雷伯氏菌与大肠杆菌和绿脓杆菌区分开来。本发明的用于鉴定肺炎克雷伯氏菌的引物，包含引物对K1或/和引物对K2；其中，K1包括K1-F和K1-R，K2包括K2-F和K2-R；所述K1-F、K1-R、K2-F、K2-R的核苷酸序列分别为序列表中的SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4。
【IPC分类】C12N15-11, C12R1-22, C12Q1-68, C12Q1-10
【公开号】CN104531887
【申请号】CN201510020845
【发明人】王贵升, 张婷婷, 田夫林, 王金宝, 单虎
【申请人】山东省动物疫病预防与控制中心
【公开日】2015年4月22日
【申请日】2015年1月15日