含有包含蛋白g的细胞膜外结构域变体的串联型多聚体的蛋白质的捕获剂的制作方法
【专利说明】含有包含蛋白G的细胞膜外结构域变体的串联型多聚体的 蛋白质的捕获剂 【技术领域】
[0001] 本发明涉及含对有免疫球蛋白G的Fc区域的蛋白质有结合活性的细胞膜外结构 域变体的串联型多聚体的蛋白质固定到水不溶性的固相支持体的，有抗体、免疫球蛋白G 或免疫球蛋白G的Fc区域的蛋白质的捕获剂、及填充该捕获剂而成的蛋白质分离纯化用层 析用柱等。 【【背景技术】】
[0002] 蛋白G是来源于链球菌的蛋白质，其是在链球菌（Streptococcus)属链球菌的细 胞膜中存在的膜蛋白质，已知对免疫球蛋白G(抗体中的一种）的Fc区域具有特异性结合 活性（非专利文献1、专利文献1)。蛋白G是由多个结构域组成的多结构域型膜蛋白质， 显示有对具有免疫球蛋白G的Fc区域的蛋白质的结合活性（以下，称为"抗体结合活性"） 的是其中的一部分的细胞膜外结构域（非专利文献2)。例如在图1中显示的来源于G148 株的蛋白G的情况中，显示抗体结合活性的是B1、B2、B3这3个结构域（有文献也记做C1、 C2、C3结构域）。另外，在GX7805株的蛋白G中存在3个抗体结合结构域，在GX7809的蛋 白G中存在2个抗体结合结构域。已知这些均为将近60个氨基酸的小型蛋白质，在其氨基 酸序列之间显示了高的相同性）。另外已知，切断蛋白G而将各结构域单独分开，仍保持抗 体结合活性（非专利文献3)。
[0003] 对于蛋白G的细胞膜外结构域而言，现在已上市，利用其选择性的抗体结合活性 的多种含有蛋白G细胞膜外结构域的制品（例如，用于抗体纯化的亲和层析用载体（专利 文献3、4)或用于检测抗体的检查试剂、研宄试剂等）。已知蛋白G的细胞膜外结构域和抗 体的结合力在中性?弱酸性区域高，在强酸性区域低（非专利文献4)。所以，当目的是抗 体的分离、回收、纯化时，首先，使含血清等的抗体的样品溶液处于中性状态，使接触固定化 蛋白G的细胞膜外结构域的珠等的水不溶性的固相支持体，选择性地吸附抗体。此后，用中 性?弱酸溶液（PH5?8)清洗而除去抗体以外的成分。最后，通常加pH2. 4?3. 5的强酸 性溶液而使抗体从固定化的蛋白G脱离，与强酸性溶液一同洗脱（专利文献3)。由此，可以 高的纯度分离、回收、纯化抗体。
[0004] 但是，抗体置于pH2. 4?3. 5的强酸性溶液的话会因变性凝集等而品质下降，根据 抗体种类的不同，有时还会丧失原本的功能（非专利文献4)。为了防止这类事件发生，尝试 在比pH2. 4?3. 5更高的pH的弱酸性区域处理，但由于蛋白G的细胞膜外结构域和抗体的 结合力强，在弱酸性区域抗体不从蛋白G上洗脱下来，得不到足够的回收量。另一方面，已 知蛋白G细胞膜外结构域还与Fab结合（非专利文献2)、一个抗体分子可在Fc区域和Fab 区域这2个区域与蛋白G细胞膜外结构域结合。一旦变成这样的结合状态，则抗体和蛋白 G的细胞膜外结构域不容易解离，难以回收抗体。
[0005] 至今本发明人等也开发过由有热稳定性、对变性剂的化学稳定性、及对蛋白质分 解酶的抗性等（有时将这些特性总称，简称为"蛋白质稳定性"）的蛋白G的细胞膜外结构 域突变体组成的改性蛋白质（专利文献5及专利文献6)、还开发过在弱酸性区域的免疫球 蛋白的Fc区域和的结合性和/或同Fab区域的结合性降低的改性蛋白质（专利文献7)。 但是，这些改性蛋白质均仅含显示抗体结合活性的1个结构域。
[0006] 【现有技术文献】
[0007] 【专利文献】
[0008] 专利文献1:特表平03-501801公报
[0009] 专利文献2:专利第2764021号公报
[0010] 专利文献3:特开平03-128400号公报
[0011] 专利文献4:特开2003-088381号公报
[0012] 专利文献5:特开2009-95322号公报
[0013] 专利文献6:特开2009-118749号公报
[0014] 专利文献7:特开2009-297018号公报
[0015] 【非专利文献】
[0016] 非专利文献 1 :Bjorck L，Kronvall G. (1984)Purification and some properties of streptococcal protein G，a novel IgG-binding reagent. J Immunol. 133,969_974〇
[0017] 非专利文献 2:Boyle M. D. P.，Ed. (1990)Bacterial Immunoglobulin Binding Proteins. Academic Press，Inc.，San Diego, CA，USA〇
[0018] 非专利文献 3:Gallagher T，Alexander P，Bryan P，Gilliland GL. (1994)Two crystal structures of the B1 immunoglobulin-binding domain of streptococcal protein G and comparison with NMR. Biochemistry 19,4721_4729〇
[0019] 非专利文献 4:Gagnon P. (1996)Purification Tools for Monoclonal Antibodies，Validated Biosystems Inc.，Tucson，AZ，USA〇 【
【发明内容】
】
[0020] 【发明要解决的技术课题】
[0021] 从而，本发明要解决的课题是解决上述现有技术中的问题，再者，提供针对具有抗 体、免疫球蛋白G或免疫球蛋白G的Fc区域的蛋白质（抗体等）的捕获剂，其以含有可用 作抗体纯化用亲和层析填充剂等的、固定了实用性优良的新蛋白质为特征。
[0022] 更具体而言，本发明要解决的另外的课题是通过使用不损害在中性域的高的抗体 结合活性的，与含野生型的蛋白G的细胞膜外结构域的蛋白质相比，在弱酸性域的与免疫 球蛋白的Fc区域的结合性和/或与同Fab区域的结合性进一步降低的优良的蛋白质，提供 能使抗体不变性地容易地捕获、回收的抗体等的捕获剂。
[0023] 再者，本发明要解决的课题是提供填充该捕获剂而成的蛋白质分离纯化用层析用 柱，特别是，抗体纯化用的亲和层析用柱。
[0024] 【解决课题的技术方案】
[0025] 本发明人想到，从固定化蛋白G的细胞膜外结构域的固相支持体进行抗体的酸洗 脱时，为了防止抗体被强酸降低质量，认为可以通过改变蛋白G的细胞膜外结构域的氨基 酸序列使之可被弱酸性溶液从固相支持体洗脱。锐意研宄的结果终于开发出串联连结抗体 结合性蛋白质的蛋白G的细胞膜外结构域突变体而构成的由串联型多聚体组成的蛋白质， 经确认该蛋白质有与野生型蛋白G同等的在中性区域的与免疫球蛋白Fc区域的结合性，并 且，在弱酸性区域的与免疫球蛋白Fc区域的结合性比野生型蛋白G细胞膜外结构域的串联 型多聚体还大大降低。还有，由此串联型多聚体组成的蛋白质对IgGl及IgG3等不同亚类 的人免疫球蛋白Fc区域显示同样的效果，此外，经确认此串联型多聚体相比由相同的结构 域突变体组成的单体中性区域的抗体结合性更为优良。
[0026] 接下来发现，通过将含涉及的细胞膜外结构域变体的串联型多聚体的蛋白质主要 经氨基固定到水不溶性的固相支持体，得到有抗体、免疫球蛋白G或免疫球蛋白G的Fc区 域的蛋白质的捕获剂，该捕获剂在作为柱填充剂使用时，有接下来定义的静态抗体吸附容 量（SBC:Static Binding Capacity)高的作为抗体等的蛋白质的捕获剂有非常优良的吸附 特性，从而完成本发明。
[0027] 即，本发明的各实施方式如下。
[0028] 【实施方式1】
[0029] 有抗体、免疫球蛋白G或免疫球蛋白G的Fc区域的蛋白质的捕获剂，其将包含对 有免疫球蛋白G的Fc区域的蛋白质有结合活性的细胞膜外结构域变体的串联型多聚体的 蛋白质主要经氨基固定到水不溶性的固相支持体而成。
[0030] 【实施方式2】
[0031] 实施方式1所述的捕获剂，其是将包含对有免疫球蛋白G的Fc区域的蛋白质有结 合活性的细胞膜外结构域变体的串联型多聚体的蛋白质固定到水不溶性的固相支持体而 成的、有抗体、免疫球蛋白G或免疫球蛋白G的Fc区域的蛋白质的捕获剂，且静态抗体吸附 容量（SBC)是 40(mg-人 IgG/ml-gel)以上。
[0032] 【实施方式3】
[0033] 实施方式2所述的捕获剂，其中静态抗体吸附容量（SBC)是44(mg-人IgG/ ml-gel)以上。
[0034] 【实施方式4】
[0035] 实施方式1?3中任一项所述的补充剂，其中串联型多聚体是串联型三聚体。
[0036] 【实施方式5】
[0037] 实施方式1?4中任一项所述的捕获剂，其中构成多聚体的细胞膜外结构域变体 互相相同。
[0038] 【实施方式6】
[0039] 实施方式1?5中任一项所述的捕获剂，其中各细胞膜外结构域变体由接头序列 连结。
[0040] 【实施方式7】
[0041] 实施方式1?6中任一项所述的捕获剂，其中对有免疫球蛋白G的Fc区域的蛋白 质有结合活性的细胞膜外结构域是链球菌（Streptococcus)属链球菌的蛋白G的B1、B2或 者B3之任何。
[0042] 【实施方式8】
[0043] 实施方式1?7中任一项所述的捕获剂，其中蛋白质具有对免疫球蛋白G的Fc区 域的结合活性，并且，相比由野生型蛋白G ? B结构域的串联型多聚体组成的蛋白质，至少， 对免疫球蛋白G的Fab区域的结合活性和/或对Fc区域在弱酸性区域的结合活性降低。
[0044]【实施方式9】
[0045] 实施方式1?8中任一项所述的捕获剂，其中构成多聚体的至少一个细胞膜外结 构域突变体是以下的突变体蛋白质：
[0046] 是野生型蛋白G*B1结构域蛋白质的突变体蛋白质，由以下的（a)所示的氨基酸序 列组成，或由在（a)所示的氨基酸序列中，1个或数个氨基酸残基缺失、取代、插入或附加的 氨基酸序列组成，具有对免疫球蛋白G的Fc区域的结合活性，并且，相比野生型蛋白G ? B1 结构域蛋白质，至少，对免疫球蛋白G的Fab区域的结合活性和/或对Fc区域在弱酸性区 域的结合活性降低的突变体蛋白质：
[0047] (a)AspThrTyrLysLeuIleLeuAsnGlyLysXllLeuLysGlyGluThrX17Thr GluAlaValX2 2AlaAlaX25AlaGluLysValPheLysX32TyrAlaX35X36X37Gly ValX40GlyX42TrpThrTyrAspX47 X48ThrLysThrPheThrValThrGlu
[0048] (上述氨基酸序列中，X35表示Asn或Lys，X36表示Asp或Glu，X37表示Asn、 His、或者 Leu，X47 表不 Asp 或 Pro, X48 表不 Ala、Lys 或 Glu，X22 表不 Asp 或 His，X25 表 示 Thr 或 His，X32 表示 Gin 或 His，X40 表示 Asp 或 His，X42 表示 Glu 或 His，Xll 表示 Thr 或Arg，X17表示Thr或lie ;不过，同时X35是Asn或Lys、X36是Asp或Glu、X37是Asn或 Leu、X47 是 Asp 或 Pro、X48 是 Ala、Lys 或 Glu、X22 是 Asp、X25 是 Thr、X32 是 Gln、X40 是 Asp、X42是Glu、Xll是Thr，并且排除X17是Thr的情况）。
[0049] 【实施方式10】
[0050] 实施方式1?8中任一项所述的捕获剂，其中构成多聚体的至少一个细胞膜外结 构域突变体是以下的突变体蛋白质：
[0051] 是野生型蛋白G*B2结构域蛋白质的突变体蛋白质，由以下的（b)所示的氨基酸序 列组成，或由在（b)所示的氨基酸序列中，1个或数个氨基酸残基缺失、取代、插入或附加的 氨基酸序列组成，具有对免疫球蛋白G的Fc区域的结合活性，并且，相比野生型蛋白G ? B2 结构域蛋白质，至少，对免疫球蛋白G的Fab区域的结合活性和/或对Fc区域在弱酸性区 域的结合活性降低的突变体蛋白质：
[0052] (b)ThrThrTyrLysLeuValIleAsnGlyLysXllLeuLysGlyGluThrX17ThrGluAlaValX22 AlaAlaX25AlaGluLysValPheLysX32TyrAlaX35X36X37GlyValX40GlyX42TrpThrTyrAspX47X4 8ThrLysThrPheThrValThrGlu
[0053] (上述氨基酸序列中，X35表示Asn或Lys，X36表示Asp或Glu，X37表示Asn、 His、或者 Leu，X47 表不 Asp 或 Pro, X48 表不 Ala、Lys 或 Glu，X22 表不 Asp 或 His，X25 表 示 Thr 或 His，X32 表示 Gin 或 His，X40 表示 Asp 或 His，X42 表示 Glu 或 His，Xll 表示 Thr 或Arg，X17表示Thr或lie ;不过，同时X35是Asn或Lys、X36是Asp或Glu、X37是Asn或 His、X47 是 Asp 或 Pro、X48 是 Ala、Lys 或 Glu、X22 是 Asp、X25 是 Thr、X32 是 Gln、X40 是 Asp、X42是Glu、Xll是Thr，并且排除X17是Thr的情况。）
[0054] 【实施方式11】
[0055] 实施方式1?8中任一项所述的捕获剂，其中构成多聚体的至少一个细胞膜外结 构域突变体是以下的突变体蛋白质：
[0056] 是野生型蛋白G*B3结构域蛋白质的突变体蛋白质，由以下的（c)所示的氨基酸序 列组成，或由在（c)所示的氨基酸序列中，1个或数个氨基酸残基缺失、取代、插入或附加的 氨基酸序列组成，具有对免疫球蛋白G的Fc区域的结合活性，并且，相比野生型蛋白G ? B3 结构域蛋白质，至少，对免疫球蛋白G的Fab区域的结合活性和/或对Fc区域在弱酸性区 域的结合活性降低的突变体蛋白质：
[0057] (c)ThrThrTyrLysLeuValIleAsnGlyLysXllLeuLysGlyGluThrX17ThrLysAlaValX22 AlaGluX25AlaGluLysAlaPheLysX32TyrAlaX35X36X37GlyValX40GlyValTrpThrTyrAspX47X4 8ThrLysThrPheThrValThrGlu
[0058] (上述氨基酸序列中，X35表示Asn或Lys，X36表示Asp或Glu，X37表示Asn、 His、或者 Leu，X47 表不 Asp 或 Pro, X48 表不 Ala、Lys 或 Glu、X22 表不 Asp 或 His，X25 表 不 Thr 或 His，X32 表不 Gin 或 His，X40 表不 Asp 或 His，Xll 表不 Thr 或 Arg，X17 表不 Thr 或 lie ;不过，同时 X35 是 Asn 或 Lys、X36 是 Asp 或 Glu、X37 是 Asn 或 His、X47 是 Asp 或 Pro、X48 是 Ala、Lys 或 Glu、X22 是 Asp、X25 是 Thr、X32 是 Gln、X40 是 Asp、XII 是 Thr，并 且排除X17成Thr的情况）。
[0059] 【实施方式12】
[0060] 实施方式1?8中任一项所述的捕获剂，其中构成多聚体的至少一个细胞膜外结 构域突变体是以下的突变体蛋白质：
[0061] 是野生型蛋白G*B1结构域蛋白质的突变体蛋白质，由以下的（d)所示的氨基酸 序列组成，或由在（d)所示的氨基酸序列中，1个或数个氨基酸残基缺失、取代、插入或附加 的氨基酸序列组成，具有对免疫球蛋白G的Fc区域的结合活性，并且相比野生型蛋白G *B1 结构域蛋白质，对免疫球蛋白G的Fab区域的结合活性和/或对Fc区域在弱酸性区域的结 合活性降低的上述突变体蛋白质：
[0062] (d)AspThrTyrLysLeuIleLeuAsnGlyLysXllLeuLysGlyGluThrX17ThrGluAlaValX22 AlaAlaX25AlaGluLysValPheLysX32TyrAlaAsnAspAsn GlyValX40GlyX42TrpThrTyrAspAspA laThrLysThrPheThrValThrGlu
[0063] (上述氨基酸序列中，X22表示Asp或His，X25表示Thr或His，X32表示Gin或 His，X40 表不 Asp 或 His，X42 表不 Glu 或 His，XII 表不 Thr 或 Arg，X17 表不 Thr 或 lie ; 不过，同时 X22 是 Asp、X25 是 Thr、X32 是 Gln、X40 是 Asp、X42 是 Glu、XII 是 Thr，并且排 除X17是Thr的情况）。
[0064] 【实施方式13】
[0065] 实施方式1?8中任一项所述的捕获剂，其中构成多聚体的至少一个细胞膜外结 构域突变体是以下的突变体蛋白质：
[0066] 是野生型蛋白G*B2结构域蛋白质的突变体蛋白质，由以下的（e)所示的氨基酸 序列组成，或由在（e)所示的氨基酸序列中，1个或数个氨基酸残基缺失、取代、插入或附加 的氨基酸序列组成，具有对免疫球蛋白G的Fc区域的结合活性，并且相比野生型蛋白G *B2 结构域蛋白质，对免疫球蛋白G的Fab区域的结合活性和/或对Fc区域在弱酸性区域的结 合活性降低的上述突变体蛋白质：
[0067] (e)ThrThrTyrLysLeuValIleAsnGlyLysXllLeuLysGlyGluThrX17ThrGluAlaValX22 AlaAlaX25AlaGluLysValPheLysX32TyrAlaAsnAspAsn GlyValX40GlyX42TrpThrTyrAspAspA laThrLysThrPheThrValThrGlu
[0068] (上述氨基酸序列中，X22表示Asp或His，X25表示Thr或His，X32表示Gin或 His，X40 表不 Asp 或 His，X42 表不 Glu 或 His，XII 表不 Thr 或 Arg，X17 表不 Thr 或 lie ; 不过，同时 X22 是 Asp、X25 是 Thr、X32 是 Gln、X40 是 Asp、X42 是 Glu、Xll 是 Thr，并且排 除X17是Thr的情况）。
[0069] 【实施方式14】
[0070] 实施方式1?8中任一项所述的捕获剂，其中构成多聚体的至少一个细胞膜外结 构域突变体是以下的突变体蛋白质：
[0071] 是野生型蛋白G*B3结构域蛋白质的突变体蛋白质，由以下的（f)所示的氨基酸 序列组成，或由在（f)所示的氨基酸序列中，1个或数个氨基酸残基缺失、取代、插入或附加 的氨基酸序列组成，具有对免疫球蛋白G的Fc区域的结合活性，并且相比野生型蛋白G *B3 结构域蛋白质，对免疫球蛋白G的Fab区域的结合活性和/或对Fc区域在弱酸性区域的结 合活性降低的上述突变体蛋白质：
[0072] (f)ThrThrTyrLysLeuValIleAsnGlyLysXllLeuLysGlyGluThrX17ThrLysAlaValX22 AlaGluX25AlaGluLysAlaPheLysX32TyrAlaAsnAspAsn GlyValX40GlyValTrpThrTyrAspAspA laThrLysThrPheThrValThrGlu
[0073] (上述氨基酸序列中，X22表示Asp或His，X25表示Thr或His，X32表示Gin或 His，X40表示Asp或His，Xll表示Thr或Arg，X17表示Thr或lie ;不过，同时X22是Asp、 X25是Thr、X32是Gln、X40是Asp、Xll是Thr，并且排除X17是Thr的情况）。
[0074] 【实施方式I5】
[0075] 实施方式1?8中任一项所述的捕获剂，其中构成多聚体的至少一个细胞膜外结 构域突变体是以下的突变体蛋白质：
[0076] 是野生型蛋白G*B1结构域蛋白质的突变体蛋白质，由以下的（g)所示的氨基酸序 列组成，或由在（g)所示的氨基酸序列中，1个或数个氨基酸残基缺失、取代、插入或附加的 氨基酸序列组成，具有对免疫球蛋白G的Fc区域的结合活性，并且，相比野生型蛋白G ? B1 结构域蛋白质，对Fc区域在弱酸性区域的结合活性降低的上述突变体蛋白质：
[0077] (g)AspThrTyrLysLeuIleLeuAsnGlyLysThrLeuLysGlyGluThrThr ThrGluAlaValX2 2AlaAlaX25AlaGluLysValPheLysX32TyrAlaAsnAspAsn GlyValX40GlyX42TrpThrTyrAspAsp AlaThrLysThrPheThrValThrGlu
[0078] (上述氨基酸序列中，X22表示Asp或His，X25表示Thr或His，X32表示Gin或 His，X40 表示 Asp 或 His，X42 表示 Glu 或 His ;不过，同时 X22 是 Asp、X25 是 Thr、X32 是 Gln、X40是Asp，并且排除X42是Glu的情况）。