且将露出表面积比设为40%以上，从而蛋白G*B2结构域的野生型氨基酸序列（SEQ ID NO:2)之中的，Asp22、Ala24、Thr25、Lys28、Val29、Lys31、Gln32、Asn35、Asp36、Gly38、 Asp40、Glu42、Thr44的13个被选定为突变对象部位。
[0158] 另外，如上所述，由于蛋白G的各细胞膜外结构域序列相同性极其高，也几乎无 B1、B2、B3结构域的立体结构的差异，对B2结构域-Fc复合物的立体结构的见解也可适用于 B1及B3结构域-Fc复合物。从而，从B2结构域-Fc复合物的立体结构导出的13个是，突变 对象部位只要在相当的位置有相同的种类的氨基酸，不仅是在B2结构域，在B1及B2结构 域中也可选定为突变对象部位。即，蛋白G*B1结构域的野生型氨基酸序列（SEQ ID NO: 1) 之中的，Asp22、Ala24、Thr25、Lys28、Val29、Lys31、Gln32、Asn35、Asp36、Gly38、Asp40、 Glu42、Thr44的13个，另外，蛋白G ? B3结构域的野生型氨基酸序列（SEQ ID N0:3)之中 的，Asp22、Thr25、Lys28、Lys31、Gln32、Asn35、Asp36、Gly38、Asp40、Thr44 的 10 个被选定 为突变对象部位。
[0159] 另一方面，取代该突变对象部位的原来的氨基酸残基的氨基酸残基特别指定以下 的（i)?（iii)中的任何一种。
[0160] (i)突变对象部位的野生型的氨基酸残基有非带电荷的侧链的氨基酸（Gly、Ala、 Val、Leu、lie、Ser、Thr、Asn、Gin、Phe、Tyr、Trp、Met、Cys、Pro)时，被有带电荷的侧链的氨 基酸（Asp、Glu、Lys、Arg、His)取代。带电荷氨基酸依赖于pH而化学状态变化大，所以可 使蛋白G ? B2结构域的抗体结合性在中性区域和弱酸性区域变化。
[0161] (ii)突变对象部位的野生型的氨基酸残基是带电荷氨基酸时，被显示反电荷的带 电荷氨基酸取代。与上述同样地，带电荷氨基酸依赖于pH而化学状态变化大，所以可使蛋 白G ? B2结构域的抗体结合性在中性区域和弱酸性区域变化。
[0162] (iii)突变对象部位的野生型的氨基酸残基是组氨酸以外的情况时被组氨酸取 代。由于组氨酸在中性区域和弱酸性区域化学状态变化大，可使蛋白G ? B2结构域的抗体 结合性在中性区域和弱酸性区域变化。
[0163] 具体而言，如后述实施例中所示，作为取代位置的氨基酸残基，对于Asp22特别指 定Lys、Arg、或者His，对于Ala24(仅Bl，B2结构域）特别指定Asp、Glu、Lys、Arg、或者 把8，对于11^25特别指定48口、6111、1^8、4找、或者1118，对于1^828特别指定48口、6111、或者 His，对于Val29 (仅B1，B2结构域）特别指定Asp、Glu、Lys、Arg、或者His，对于Lys31特别 指定48口、6111、或者把8，对于61]132特别指定48。、6111、1^8、4找、或者1118，对于481135特别 指定48口、6111、1^8、4找、或者把8，对于48口36特别指定1^8、4找、或者把8，对于61738特别 指定48。、6111、1^8、4找、或者把8，对于48口40特别指定1^8、4找、或者把8，对于611142(仅 B1，B2结构域）特别指定Lys、Arg、或者His，对于Thr44特别指定八8?、6111、1^8、4找、或者 His。但是，由这些氨基酸残基的特别指定的氨基酸序列是，Asn35被Lys取代和/或Asp36 被Glu取代，除去该取代位置以外的氨基酸序列成为与野生型蛋白G的各细胞膜结构域的 氨基酸序列相同的情况。由此，与后述的本发明人的申请中涉及的升高蛋白G细胞膜结构 域的稳定性的突变体蛋白质区别开来。
[0164] B.本发明的突变体蛋白质的第2实施方式如以下的（3)所示。
[0165] (3)特征在于将由SEQ ID NO: 1?3中任何一个所示的氨基酸序列组成的野生型 蛋白 G ? Bl、B2 或 B3 结构域蛋白质中的，作为 LyslO、Thrll、Lysl3、Glyl4、Glul5、Thrl6、 Thrl7、Asn35、Asp36、Gly38之中的任何1个以上的氨基酸残基作为突变对象部位，被除半 胱氨酸之外的其他种类的氨基酸残基取代的，对免疫球蛋白G的Fc区域有结合活性，并且 相比各对应的野生型蛋白G ? Bl、B2或B3结构域蛋白质，对免疫球蛋白G的Fab区域的结 合性降低的突变体蛋白质。上述（3)的突变体蛋白质是基于如下选定的突变对象部位及该 部位的氨基酸残基的取代设计，由基因工程学方法得到的。
[0166] 〔基于与Fab的结合表面解析的突变对象部位的选定和取代的氨基酸残基的特别 指定〕
[0167] 导入用于设计本发明的突变体蛋白质的氨基酸序列的变异的部位使用蛋白G ? B3 结构域和免疫球蛋白G的Fab区域结合的复合物的立体结构原子座标数据（参考文献5)选 定。已知蛋白G的细胞膜外结构域对于免疫球蛋白G的Fc区域也结合，对于Fab区域也结 合（参考文献2)。从而，1个抗体分子可同时与多个蛋白G的细胞膜外结构域结合，成为这 样的状态，则抗体和蛋白G的细胞膜外结构域的相互作用成为多价，变得无容易地被切断。 从而，要想降低在弱酸性区域的蛋白G的细胞膜外结构域的抗体结合性，将与和Fab区域的 结合直接相关的蛋白G的细胞膜外结构域的结合表面的氨基酸残基从野生型取代为非野 生型即可。从而，首先，在蛋白G ? B3结构域和免疫球蛋白G的Fab区域结合的复合物中， 特别指定在从Fab区域一定的距离的范围内存在的蛋白G -各细胞膜B3结构域的氨基酸 残基，将其作为突变对象部位的候选。接下来，为了使伴随氨基酸取代的蛋白G的细胞膜外 结构域的结构不稳定化处于最小限度，上述的候选之中，仅将露出到蛋白G *B3结构域的分 子表面的氨基酸残基确定为突变对象部位。
[0168] 具体而言，如后述实施例中所示，将上述的距离范围设定为4.〇A以内，并且使露 出表面积比成为40%以上，从而[SEQ ID NO: 3]所示的蛋白G ? B3结构域的野生型氨基酸 序列之中的，LyslO、Thrll、Lysl3、Glyl4、Glul5、Thrl6、Thrl7、Asn35、Asp36、Gly38 的 10 个被选定为突变对象部位。另外，如上所述，蛋白G的各细胞膜外结构域如上所述相同性极 其高，这些的突变对象部位在B1、B2、B3的何结构域中也共同存在。从而，这些不仅是在B3 结构域，在B1及B2结构域中也可被选定为突变对象部位。
[0169] 另一方面，取代该突变对象部位的原来的氨基酸残基的氨基酸残基可由以下的方 法特别指定。（iV)被野生型的氨基酸和半胱氨酸以外的其他种类的氨基酸残基取代。由此， 除了避免伴随半胱氨酸的导入的交联反应的危险性，还可导致与由野生型的氨基酸的变异 的Fab区域的结合性的降低。
[0170] 具体而言，如后述实施例中所示，作为取代野生型蛋白G各细胞外结构域蛋白质 的氨基酸残基，对于LyslO特别指定Lys和Cys之外的残基，对于Thrll特别指定Thr和 Cys之外的残基，对于Lysl3特别指定Lys和Cys之外的残基，对于Glyl4特别指定Gly和 Cys之外的残基，对于Glul5特别指定Glu和Cys之外的残基，对于Thrl6特别指定Thr和 Cys之外的残基，对于Thrl7特别指定Thr和Cys之外的残基，对于Asn35特别指定Asn和 Cys之外的残基，对于Asp36特别指定Asp和Cys之外的残基，对于Gly38特别指定Gly和 Cys之外的残基。但是，由这些的氨基酸残基的选定的氨基酸序列是，Asn35被Lys和/或 Asp36被Glu取代，除去该取代位置以外的氨基酸序列成为与野生型蛋白G的各细胞膜结构 域的氨基酸序列相同的情况。由此，与后述的本发明人的申请中涉及的升高蛋白G细胞膜 结构域的稳定性的突变体蛋白质区别开来。
[0171] C.本发明的突变体蛋白质的第3实施方式共有用于改良对上述免疫球蛋白Fc区 域的结合性的氨基酸残基的取代和用于改良向Fab区域的结合性的氨基酸残基的取代。
[0172] 〔基于与Fc及Fab的结合表面解析的突变对象部位的选定和取代的氨基酸残基的 特别指定〕
[0173] 将基于上述与Fc的结合表面解析特定的突变对象部位和取代的氨基酸残基，及 基于上述Fab的结合表面解析特别指定的突变对象部位和取代的氨基酸残基组合，进行 突变对象部位的选定和取代的氨基酸残基的特别指定。具体而言，作为突变对象部位，蛋 白G，B1、B2结构域的野生型氨基酸序列（SEQ ID NO:l，2)之中的，Asp22、Ala24、Thr25、 Lys28、Val29、Lys31、Gln32、Asp40、Glu42、Thr44、LyslO、Thrll、Lysl3、Glyl4、Glul5、 Thrl6、Thrl7、Asn35、Asp36、Gly38 的 20 个被选定为突变对象部位。其中 Asp22、Ala24、 Thr25、Lys28、Val29、Lys31、Gln32、Asp40、Glu42、Thr44 是用于改良对 Fc 区域的结合性的 靶部位，另外，LyslO、Thrll、Lysl3、Glyl4、Glul5、Thrl6、Thrl7 是用于改良对 Fab 区域的 结合性的靶部位。其中，Asn35、Asp36、Gly38是对Fc区域的结合性的改良部位的同时是对 Fab区域的结合性的改良部位。从而，被用于对于对Asn35、Asp36、Gly38的Fc区域的结合 性的改良的上述A中所示的氨基酸残基取代也同时是用于对Fab区域的结合性的改良的， 除半胱氨酸残基之外的向其他氨基酸残基的取代。
[0174] S卩，本说明书中所说的氨基酸残基取代的"共有"是指，在用于对Fc区域的结合性 的改良的突变对象部位和用于对Fab区域的结合性的改良的突变对象部位被不同地选定 时，除了组合氨基酸残基的取代的情况之外，作为用于这两者的结合性的改良的突变对象 部位，选定相同的部位，在进行上述A中所示的氨基酸残基的取代时也以该意义定义。
[0175] 作为取代的氨基酸残基，对于Asp22选定Lys、Arg、或者His，对于Ala24选定Asp、 6111、1^8、4找、或者]^8，对于11^25选定48。、6111、1^8、4找、或者]^8，对于1^828选定八8卩、 6111、或者把8，对于\^129选定48口、6111、1^8、4找、或者]^8，对于1^831选定48。、6111、或者 His，对于 Gln32 选定 Asp、Glu、Lys、Arg、或者 His，对于 Asp40 选定 Lys、Arg、或者 His，对 于Glu42选定Lys、Arg、或者His，对于Thr44选定八8口、6111、1^8、4找、或者]^8，对于1^810 选定Lys和Cys之外的残基，对于Thrll选定Thr和Cys之外的残基，对于Lysl3选定Lys 和Cys之外的残基，对于Glyl4选定Gly和Cys之外的残基，对于Glul5选定Glu和Cys之 外的残基，对于Thrl6选定Thr和Cys之外的残基，对于Thrl7选定Thr和Cys之外的残 基，对于Asn35选定Asn和Cys之外的残基，对于Asp36选定Asp和Cys之外的残基，对于 Gly38选定Gly和Cys之外的残基。
[0176] 另一方面，对于蛋白G ? B3结构域而言，野生型氨基酸序列（SEQ ID N0:3)之中 的，Asp22、Thr25、Lys28、Lys31、Gln32、Asp40、Thr44、LyslO、Thrll、Lysl3、Glyl4、Glul5、 Thrl6、Thrl7、Asn35、Asp36、Gly38 的 17 个被选定为突变对象部位。其中 Asp22、Thr25、 Lys28、Lys31、Gln32、Asp40、Thr44是用于改良对Fc区域的结合性的突变对象部位，另外， LyslO、Thrll、Lysl3、Glyl4、Glul5、Thrl6、Thrl7是用于改良对Fab区域的结合性的突变 对象部位。其中Asn35、Asp36、Gly38是对Fc区域的结合性的改良部位的同时也是对Fab 区域的结合性的改良部位的点是共同的，被用于对于对Asn35、Asp36、Gly38的Fc区域的结 合性的改良的上述A中所示的氨基酸残基取代也同时是用于对Fab区域的结合性的改良的 除半胱氨酸残基之外的向其他氨基酸残基的取代，这与上述蛋白G ? B1或B2结构域同样。
[0177] 但是，基于上述氨基酸残基的选定设定的氨基酸序列是Asn35被Lys取代和/或 Asp36被Glu取代，除去该取代位置以外的氨基酸序列成为与野生型蛋白G的各细胞膜结构 域的氨基酸序列相同的情况。由此，与后述的本发明人的申请中涉及的升高蛋白G细胞膜 结构域的稳定性的突变体蛋白质区别开来。
[0178] 本发明的突变体蛋白质的具体例如以下（a)?（c)中所示。
[0179] (a)是野生型蛋白G*B1结构域蛋白质的突变体蛋白质，由以下的（a)所示的氨 基酸序列组成，或由在（a)所示的氨基酸序列中，1个或数个氨基酸残基缺失、取代、插入或 附加的氨基酸序列组成，具有对免疫球蛋白G的Fc区域的结合活性，并且，相比野生型蛋白 G *B1结构域蛋白质，至少，对免疫球蛋白G的Fab区域的结合活性和/或对Fc区域在弱酸 性区域的结合活性降低的突变体蛋白质。
[0180] (a)AspThrTyrLysLeuIleLeuAsnGlyLysXllLeuLysGlyGluThrX17ThrGluAlaValX22 AlaAlaX25AlaGluLysValPheLysX32TyrAlaX35X36X37GlyValX40GlyX42TrpThrTyrAspX47X4 8ThrLysThrPheThrValThrGlu
[0181] (上述氨基酸序列中，X35表示Asn或Lys，X36表示Asp或Glu，X37表示Asn、 His、或者 Leu，X47 表不 Asp 或 Pro, X48 表不 Ala、Lys 或 Glu，X22 表不 Asp 或 His，X25 表 示 Thr 或 His，X32 表示 Gin 或 His，X40 表示 Asp 或 His，X42 表示 Glu 或 His，Xll 表示 Thr 或Arg，X17表示Thr或lie ;不过，同时X35是Asn或Lys、X36是Asp或Glu、X37是Asn或 Leu、X47 是 Asp 或 Pro、X48 是 Ala、Lys 或 Glu、X22 是 Asp、X25 是 Thr、X32 是 Gln、X40 是 Asp、X42是Glu、Xll是Thr，并且排除X17是Thr的情况。）
[0182] (b)是野生型蛋白G*B2结构域蛋白质的突变体蛋白质，由以下的（b)所示的氨 基酸序列组成，或由在（b)所示的氨基酸序列中，1个或数个氨基酸残基缺失、取代、插入或 附加的氨基酸序列组成，具有对免疫球蛋白G的Fc区域的结合活性，并且，相比野生型蛋白 G*B2结构域蛋白质，至少，对免疫球蛋白G的Fab区域的结合活性和/或对Fc区域在弱酸 性区域的结合活性降低的突变体蛋白质。
[0183] (b)ThrThrTyrLysLeuValIleAsnGlyLysXllLeuLysGlyGluThrX17ThrGluAlaValX22 AlaAlaX25AlaGluLysValPheLysX32TyrAlaX35X36X37GlyValX40GlyX42TrpThrTyrAspX47X4 8ThrLysThrPheThrValThrGlu
[0184] (上述氨基酸序列中，X35表示Asn或Lys，X36表示Asp或Glu，X37表示Asn、 His、或者 Leu，X47 表不 Asp 或 Pro, X48 表不 Ala、Lys 或 Glu，X22 表不 Asp 或 His，X25 表 示 Thr 或 His，X32 表示 Gin 或 His，X40 表示 Asp 或 His，X42 表示 Glu 或 His，Xll 表示 Thr 或Arg，X17表示Thr或lie ;不过，同时X35是Asn或Lys、X36是Asp或Glu、X37是Asn或 Leu、X47 是 Asp 或 Pro、X48 是 Ala、Lys 或 Glu、X22 是 Asp、X25 是 Thr、X32 是 Gln、X40 是 Asp、X42是Glu、Xll是Thr，并且排除X17是Thr的情况。）
[0185] (c)是野生型蛋白G*B3结构域蛋白质的突变体蛋白质，由以下的（c)所示的氨 基酸序列组成，或由在（c)所示的氨基酸序列中，1个或数个氨基酸残基缺失、取代、插入或 附加的氨基酸序列组成，具有对免疫球蛋白G的Fc区域的结合活性，并且，相比野生型蛋白 G*B3结构域蛋白质，至少，对免疫球蛋白G的Fab区域的结合活性和/或对Fc区域在弱酸 性区域的结合活性降低的突变体蛋白质。
[0186] (c)ThrThrTyrLysLeuValIleAsnGlyLysXllLeuLysGlyGluThrX17ThrLysAlaValX22 AlaGluX25AlaGluLysAlaPheLysX32TyrAlaX35X36X37GlyValX40GlyValTrpThrTyrAspX47X4 8ThrLysThrPheThrValThrGlu
[0187] (上述氨基酸序列中，X35表示Asn或Lys，X36表示Asp或Glu，X37表示Asn、His、 或者 Leu，X47 表示 Asp 或 Pro, X48 表示 Ala、Lys 或 Glu、X22 表示 Asp 或 His，X25 表示 Thr 或 His，X32 表不 Gin 或 His，X40 表不 Asp 或 His，XII 表不 Thr 或 Arg，X17 表不 Thr 或 lie ; 不过，同时 X35 是 Asn 或 Lys、X36 是 Asp 或 Glu、X37 是 Asn 或 Leu、X47 是 Asp 或 Pro、X48 是 Ala、Lys 或 Glu、X22 是 Asp、X25 是 Thr、X32 是 Gln、X40 是 Asp、X42 是 Glu、Xll 是 Thr， 并且排除X17是Thr的情况。）
[0188] 再有，上述（a)?（c)的氨基酸残基的定义中，条件是与野生型蛋白G的各细胞膜 结构域蛋白质及后述的本发明人的申请中涉及的升高蛋白G细胞膜结构域的稳定性的突 变体蛋白质区别开来。
[0189] 更具体性的本发明的突变体蛋白质加以下的（d)?（i)中所示。
[0190] (d)是野生型蛋白G-B1结构域蛋白质的突变体蛋白质，由以下的⑷所示的氨 基酸序列组成，或由在（d)所示的氨基酸序列中，1个或数个氨基酸残基缺失、取代、插入或 附加的氨基酸序列组成，具有对免疫球蛋白G的Fc区域的结合活性，并且相比野生型蛋白 G ? B1结构域蛋白质，对免疫球蛋白G的Fab区域的结合活性和/或对Fc区域在弱酸性区 域的结合活性降低的上述突变体蛋白质。
[0191] (d)AspThrTyrLysLeuIleLeuAsnGlyLysXllLeuLysGlyGluThrX17ThrGluAlaValX22 AlaAlaX25AlaGluLysValPheLysX32TyrAlaAsnAspAsn GlyValX40GlyX42TrpThrTyrAspAspA laThrLysThrPheThrValThrGlu
[0192] (上述氨基酸序列中，X22表示Asp或His，X25表示Thr或His，X32表示Gin或 His，X40 表不 Asp 或 His，X42 表不 Glu 或 His，XII 表不 Thr 或 Arg，X17 表不 Thr 或 lie ; 不过，同时 X22 是 Asp、X25 是 Thr、X32 是 Gln、X40 是 Asp、X42 是 Glu、XII 是 Thr，并且排 除X17是Thr的情况。）
[0193] (e)是野生型蛋白G*B2结构域蛋白质的突变体蛋白质，由以下的（e)所示的氨 基酸序列组成，或由在（e)所示的氨基酸序列中，1个或数个氨基酸残基缺失、取代、插入或 附加的氨基酸序列组成，具有对免疫球蛋白G的Fc区域的结合活性，并且相比野生型蛋白 G ? B2结构域蛋白质，对免疫球蛋白G的Fab区域的结合活性和/或对Fc区域在弱酸性区 域的结合活性降低的上述突变体蛋白质。
[0194] (e)ThrThrTyrLysLeuValIleAsnGlyLysXllLeuLysGlyGluThrX17ThrGluAlaValX22 AlaAlaX25AlaGluLysValPheLysX32TyrAlaAsnAspAsn GlyValX40GlyX42TrpThrTyrAspAspA laThrLysThrPheThrValThrGlu
[0195] (上述氨基酸序列中，X22表示Asp或His，X25表示Thr或His，X32表示Gin或 His，X40 表不 Asp 或 His，X42 表不 Glu 或 His，XII 表不 Thr 或 Arg，X17 表不 Thr 或 lie ; 不过，同时 X22 是 Asp、X25 是 Thr、X32 是 Gln、X40 是 Asp、X42 是 Glu、XII 是 Thr，并且排 除X17是Thr的情况。）
[0196] (f)是野生型蛋白G*B3结构域蛋白质的突变体蛋白质，由以下的（f)所示的氨 基酸序列组成，或由在（f)所示的氨基酸序列中，1个或数个氨基酸残基缺失、取代、插入或 附加的氨基酸序列组成，具有对免疫球蛋白G的Fc区域的结合活性，并且相比野生型蛋白 G ? B3结构域蛋白质，对免疫球蛋白G的Fab区域的结合活性和/或对Fc区域在弱酸性