表达肿瘤血管标记分子的癌细胞/dc融合肿瘤疫苗及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物医学领域中表达肿瘤血管标记分子的癌细胞/DC融合肿瘤疫苗 及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 恶性肿瘤的免疫治疗已经成为手术、放疗和化疗之外的一种新的治疗方法。其中 肿瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocyte, CTL)过继治疗法一直是肿瘤 免疫治疗的研究重点。肿瘤细胞和树突状细胞（dendritic cells, DC)融合作为一种诱导 CTL的有效方法已被广泛接受。但是融合疫苗的治疗效果仍不理想，需要新方法增强融合细 胞诱导CTL的有效性和靶向性。
[0003] Endoglin (又称⑶105,分化群105)是一种肿瘤血管的标记分子，是同型二聚体跨 膜糖蛋白，分子量为180kDa，是转化生长因子-β (transforming growth factor, TGF-β) 受体的一部分，可调控细胞对TGF-β的反应，通过抑制TGF-β的生物学效应而促进内皮细 胞增殖。
【发明内容】
[0004] 本发明所要解决的技术问题是如何治疗肿瘤。
[0005] 为解决上述技术问题，本发明首先提供了制备融合细胞的方法。
[0006] 本发明所提供的制备融合细胞的方法，包括将肿瘤细胞和树突状细胞进行融合得 到融合细胞的步骤；
[0007] 所述肿瘤细胞为M或N :
[0008] Μ、所述肿瘤细胞为表达Endoglin的重组细胞；
[0009] Ν、所述肿瘤细胞为含有编码所述Endoglin的基因的重组细胞；
[0010] 所述Endoglin为下述Al)或Α2)的蛋白质：
[0011] Al)氨基酸序列为SEQ ID No. 1的蛋白质；
[0012] A2)在SEQ ID No. 1所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或 几个氨基酸残基得到的具有相同功能的由Al)衍生的蛋白质。
[0013] 上述A2)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。 上述A2)中的蛋白质的编码基因可通过将SEQ ID No.2的第1位-第1683位核苷酸所示 的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义 突变，和/或在其5'端和/或3'端连上SEQ ID No. 2的第1705位-第2424位核苷酸所 示的荧光蛋白的编码序列得到。
[0014] 其中，SEQ ID No. 2的第1位-第1683位核苷酸编码氨基酸序列为SEQ ID No. 1 的Endoglin，SEQ ID No. 2的第1705位-第2424位核苷酸编码EGFP。
[0015] 上述制备融合细胞的方法中，所述Endoglin的C末端或N末端可融合有His、 Flag、GST、MBP、His-MBP、HA、eGFP、eCFP、eYFP、Myc、His-Myc、His-AviTag、Sumo、His-Sumo、 SNAP-Tag 或 Halo Tag 标签。
[0016] 上述制备融合细胞的方法中，所述表达Endoglin的肿瘤细胞是将所述Endoglin 的编码基因导入受体肿瘤细胞中得到的重组细胞。
[0017] 上述制备融合细胞的方法中，所述Endoglin的编码基因为如下All)或A21)或 A31)所不的核酸分子：
[0018] All)序列表中SEQ ID No. 2的第1位-第1683位核苷酸所不的DNA分子；
[0019] A21)与All)限定的核苷酸序列具有75 %或75 %以上同一性，且编码所述 Endoglin的cDNA分子或基因组DNA分子；
[0020] A31)在严格条件下与All)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述Endoglin的CDNA 分子或基因组DNA分子。
[0021] 这里使用的术语"同一性"指与天然核酸序列的序列相似性。"同一性"包括与本 发明的SEQ ID No. 2的第1位-第1683位核苷酸序列具有75%或更高，或85%或更高，或 90%或更高，或95%或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评 价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比（％)表示，其可以用来 评价相关序列之间的同一性。
[0022] 上述制备融合细胞的方法中，所述严格条件是在2XSSC，0. 1% SDS的溶液中，在 68°C下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0. 5 X SSC，0. 1 % SDS的溶液中，在68°C下杂交并洗 膜2次，每次15min。
[0023] 上述75%或75%以上同一性，可为80%、85%、90%或95%以上的同一性。
[0024] 上述制备融合细胞的方法中，所述重组细胞表达所述Endoglin。
[0025] 上述制备融合细胞的方法中，所述受体肿瘤细胞为肝癌细胞，具体可为HepG2。
[0026] 上述制备融合细胞的方法中，所述树突状细胞为从外周血中制备的树突状细胞。
[0027] 为解决上述技术问题，本发明还提供了融合细胞。
[0028] 本发明所提供的融合细胞为利用上述制备融合细胞的方法得到的融合细胞。
[0029] 为解决上述技术问题，本发明还提供了治疗和/或预防肿瘤药物。
[0030] 本发明所提供的治疗和/或预防肿瘤药物的活性成分为下述Hl和/或H2 :
[0031] H1、所述融合细胞；
[0032] H2、所述融合细胞诱导T淋巴细胞得到的分泌IFN- Y的T淋巴细胞。
[0033] 上述治疗和/或预防肿瘤药物中，所述治疗和/或预防肿瘤药物可为治疗和/或 预防肝癌药物。
[0034] 为解决上述技术问题，本发明还提供了融合细胞在制备治疗和/或预防肿瘤药物 中的应用或在制备分泌IFN- γ的T淋巴细胞中的应用。
[0035] 上述应用中，所述融合细胞可为利用上述制备融合细胞的方法得到的融合细胞。
[0036] 上述应用中，所述治疗和/或预防肿瘤药物可为治疗和/或预防肝癌药物。
[0037] 为解决上述技术问题，本发明还提供了 Endoglin在制备治疗和/或预防肿瘤药物 中的应用。
[0038] 上述应用中，所述治疗和/或预防肿瘤药物可为治疗和/或预防肝癌药物。
[0039] 为解决上述技术问题，本发明还提供了与Endoglin相关的生物材料在制备治疗 和/或预防肿瘤药物中的应用。
[0040] 本发明所提供的与Endoglin相关的生物材料在制备治疗和/或预防肿瘤药物中 的应用中，所述生物材料为下述El)至E20)中的任一种：
[0041] El)编码所述Endoglin的核酸分子；
[0042] E2)含有El)所述核酸分子的表达盒；
[0043] E3)含有El)所述核酸分子的重组载体；
[0044] E4)含有E2)所述表达盒的重组载体；
[0045] E5)含有El)所述核酸分子的重组微生物；
[0046] E6)含有E2)所述表达盒的重组微生物；
[0047] E7)含有E3)所述重组载体的重组微生物；
[0048] E8)含有E4)所述重组载体的重组微生物；
[0049] E9)含有El)所述核酸分子的转基因动物细胞系；
[0050] E10)含有E2)所述表达盒的转基因动物细胞系；
[0051] El 1)含有E3)所述重组载体的转基因动物细胞系；
[0052] E12)含有E4)所述重组载体的转基因动物细胞系；
[0053] E13)含有El)所述核酸分子的转基因动物组织；
[0054] E14)含有E2)所述表达盒的转基因动物组织；
[0055] E15)含有E3)所述重组载体的转基因动物组织；
[0056] E16)含有E4)所述重组载体的转基因动物组织；
[0057] E17)含有El)所述核酸分子的转基因动物器官；
[0058] E18)含有E2)所述表达盒的转基因动物器官；
[0059] E19)含有E3)所述重组载体的转基因动物器官；
[0060] E20)含有E4)所述重组载体的转基因动物器官。
[0061] 上述应用中，E2)所述的含有编码Endoglin的核酸分子的表达盒，是指能够在宿 主细胞中表达Endoglin的DNA，该DNA不但可包括启动Endoglin的编码基因转录的启动 子，还可包括终止Endoglin编码基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子 序列。
[0062] 可用现有的表达载体构建含有所述Endoglin编码基因表达盒的重组载体。
[0063] 上述应用中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。