PBMC液体体积的37°C不全RIPM 1640 (即不 含血清的RIPM 1640)洗涤，llOOrpm，IOmin ;再用4倍于PBMC液体体积的37°C不全RIPM 1640(即不含血清的RIPM 1640)洗漆，lOOOrpm，离心IOmin ;
[0108] S5、用完全RIPM 1640(即含血清的RIPM 1640)重悬细胞，放于培养瓶中。在37°C， 5% CO2培养箱内培养2小时（贴壁细胞即为树突状细胞（DC)的前体细胞（记为DC培养 第 0 天的 DC))，加入 1000U/mL rhGM-CSF 和 500U/mL rhIL-4,置于 37°C，5% CO2培养箱内。 DC培养过程中每三天用含有1000U/mL rhGM-CSF、500U/mL rhIL-4的完全RIPM 1640半量 换液；
[0109] S6、在DC培养第5天DC基本呈悬浮状态，加入25ng/mL的rhTNF-α，继续置于 37%，5% CO2培养箱内培养，在DC培养第7天得到成熟DC。该成熟DC的细胞形态为体积 变大，呈集落生长有根须状毛刺状突起，形态不规则。
[0110] 经过流式细胞仪测定上述成熟树突状细胞（DC)表达⑶83、⑶86、HL A -DR 和HLA-ABC的水平。首先将上述成熟树突状细胞（DC)分别与FITC-抗HLA-DR抗体 (ebioscience 产品，货号为 11-9956-42)、FITC-抗 HLA-ABC 抗体（ebioscience 产品，货 号为 11-9983-41)、FITC-抗 CD83 抗体（ebioscience 产品，货号为 11-0839-42)和 PE-抗 CD86抗体（ebioscience产品，货号为25-0869-42)在PBS中反应45分钟，反应结束后以 PBS洗三次，上机分析。结果显示成熟DC高表达⑶83、⑶86、HLA-DR和HLA-ABC，分别达到 85. 7±4· 79%，93· 8±2· 75%，97. 06±1· 30%，99· 37±0· 35%，与 DC 培养第 0 天的 DC(DC 的前体细胞）相比，⑶83、⑶86、HLA-DR的表达有了明显的增高，表明上述步骤中得到的树 突状细胞（DC)为成熟DC。
[0111] 3、融合细胞的制备
[0112] 3. 1将步骤2的成熟DC用不含血清的RIPM 1640洗一遍。弃上清，加入500 μ L Diluent C(NEB，B8003S)重悬成单个细胞悬液。另在 500yL Diluent C 加入 IyL ΡΚΗ26 原液（Sigma)混匀,然后立即加入细胞中，室温孵育4min。加入ImL小牛血清终止lmin,用 6mL完全RIPM 1640培养基洗三次备用，得到染色后的DC，以上步骤需避光进行。
[0113] 3. 2步骤1的处于对数期的H印G2 (Eng+)肿瘤细胞染色步骤：肿瘤细胞用不含血 清的RIPM 1640洗一遍。弃上清，加入ImL含0.1% (质量百分比浓度）BSA的PBS重悬 成单个细胞悬液。另在ImL含0.1 (质量百分比浓度）％ BSA的PBS加入3μ L FITC原液 (Sigma公司）混勻，然后立即加入细胞中，37?孵育8min，每2min震荡一次。加入ImL小 牛血清终止lmin，用6mL完全RIPM 1640培养基洗三次，得到染色后的肿瘤细胞，以上步骤 需避光进行。
[0114] 3. 3将步骤3. 1的染色后的DC和步骤3. 2的染色后的肿瘤细胞混合，1500rpm离 心IOmin后倾倒上清，不加培养液于38°C孵育4min。沿离心管壁缓慢加入38°C下预热的 PEG2000250 μ L，滴加过程中要缓慢的旋转离心管，使细胞和PEG2000充分接触。然后38°C， 孵育4min。缓慢沿管壁加40mL PBS终止融合，1200rpm，离心IOmin洗涤一遍，加入培养液 含10%胎牛血清的完全DMEM置于37°C，5% CO2培养箱内培养24h后收集悬浮细胞，按照 如下方法的双荧光染色法选出融合细胞：检测上述待测细胞悬液中的细胞，步骤1的处于 对数期的H印G2 (Eng+)只发出绿色荧光不发出红色荧光，步骤2的成熟DC只发出红色荧光 不发出绿色荧光，二者的融合细胞既能发出红色荧光和又发出绿色荧光，选出既能发出红 色荧光和又发出绿色荧光的融合细胞（图2)，将该融合细胞命名为DC/!fepG2(Eng+)。结果 表明，融合细胞DC/!fepG2(Eng+)出现的百分率为65%。
[0115] 按照上述方法，将处于对数期的IfepG2 (Eng+)替换为步骤1得到的处于对数期的 !fepG2细胞，其他步骤不变，得到H印G2和DC的融合细胞DC/!fepG2。
[0116] 按照上述方法，将处于对数期的HepG2(Eng+)替换为步骤1得到的处于对数 期的H印G2 (pLVX-Puro)，其他步骤不变，得到H印G2 (pLVX-Puro)和DC的融合细胞DC/ !fepG2 (pLVX-Puro)。
[0117] 实施例2、DC/!fepG2 (Eng+)体外诱导分泌IFN- γ的T淋巴细胞的产生
[0118] 实验重复三次，每次重复实验的具体步骤如下：
[0119] 按照下述方法得到DC/HepG2 (Eng+)诱导的分泌IFN- Y的T淋巴细胞，并用酶联 免疫斑点法（enzyme I inked immunospot assay，ELISP0T)进行检测T淋巴细胞分泌的 IFN-γ，所用IXWashing buffer、生物素标记的抗体、酶标亲和素均为Human IFN-gamma precoated ELISP0T kit (Human IFN-gamma precoated ELISP0T kit 为达科为生物技术有 限公司产品，货号为DKW22-1000-048)中的试剂，具体步骤如下：
[0120] 1)取出试剂盒中的孔板，向每孔中加入200 μ L不全RIPM 1640培养基，室温静置 5-10分钟，将液体倒掉。
[0121] 2)向每孔均加入用不全RIPM 1640培养基悬浮的实施例1的DC/ H印G2 (Eng+) 3 X IO4个和T淋巴细胞3 X 10 5个。每孔100 μ L液体量，每组4个复孔。
[0122] 3)孵育：盖好板盖，放入培养箱培养5天，得到DC/HepG2 (Eng+)诱导的分泌 IFN-Y的T淋巴细胞。
[0123] 4)裂解步骤3)的DC/!fepG2 (Eng+)诱导的分泌IFNi的T淋巴细胞：倾倒孔内 细胞及培养基。向每孔中加入200 μ L 4°C预冷的去离子水，4°C冰箱放置15分钟低渗裂解 细胞。
[0124] 5)洗板：倾倒培养板内的液体，每次每孔用200 μ L IXWashing buffer洗漆，共 洗5次，每次停留60-80秒。最后一次，倾倒出培养板内的液体后，将培养板倒扣在吸水纸 上至培养板中无液体。
[0125] 6)检测抗体孵育：将用无菌水按照生物素标记的抗体：无菌水=1:1000的比例稀 释得到的生物素标记的抗体加入培养板的每孔中，每孔100 μ L。37°C孵育1小时。
[0126] 7)洗板：倾倒培养板内的液体，加入I XWashing buffer,每孔200 μ L，洗漆5-6 次。每次停留60-80秒。最后一次，在吸水纸上扣干。
[0127] 8)酶联亲和素孵育：将用无菌水按照酶标亲和素：无菌水=1:100的比例稀释得 到的酶标亲和素加入培养板的每孔中，每孔100 μ L。37°C孵育1小时。
[0128] 9)洗板：倾倒培养板内的液体，加入I XWashing buffer,每孔200 μ L，洗漆5-6 次。每次停留60-80秒。最后一次，在吸水纸上扣干。
[0129] 10)显色：将新鲜配制的AEC显色液工作液加入各实验孔，每孔100 μ L。室温避光 静置15-50分钟。
[0130] 11)终止显色：倾倒培养板内的液体，揭开板底座，用去自来水冲洗培养板正反面 及底座5遍，终止显色。
[0131] 12)板晾干后用CTL仪器设置阈值分析，并记录斑点参数，做统计学分析。
[0132] 按照上述方法，将 DC/!fepG2 (Eng+)分别替换为 DC/!fepG2、DC/H印G2 (pLVX-Puro)、 DC、!fepG2 (Eng+)、!fepG2 和 H印G2 (pLVX-Puro)，分别得到 DC/!fepG2 诱导的 T 淋巴细胞、DC/ !fepG2 (pLVX-Puro)诱导的T淋巴细胞、DC诱导的T淋巴细胞、！fepG2 (Eng+)诱导的T淋巴 细胞、！fepG2诱导的T淋巴细胞和H印G2(pLVX-Puro)诱导的T淋巴细胞，及这些T淋巴细 胞分泌的IFN-Y的量的酶联免疫斑点检测结果。
[0133] 结果显示，！fepG2 (Eng+)、！fepG2和！fepG2 (pLVX-Puro)体外诱导的T淋巴细胞几 乎不分泌IFN- γ ;DC/HepG2 (Eng+)诱