一种基于磁珠法快速提取革兰氏阳性菌基因组dna的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及一种基于磁珠法快速提取革兰氏阳性菌基因 组DNA的方法。
【背景技术】
[0002] 革兰氏阳性菌是能够用革兰氏染色染成深蓝或紫色的细菌，而革兰氏阴性菌不 能被染色（但会涂成红色以对比）。革兰氏阳性菌细胞壁中含有较大量的肽聚糖，但经常 缺乏革兰氏阴性菌所拥有的第二层膜和脂多糖层。革兰氏阳性细菌的细胞壁较厚（20? 80nm)，主要是由肽聚糖和磷壁酸组成的，仅有一层结构，主要成分为肽聚糖，占细胞壁干重 的50%?90%。在染色过程中，当用乙醇处理时，由于脱水而引起网状结构中的孔径变小， 通透性降低，使结晶紫-碘复合物被保留在细胞内而不易脱色，因此，呈现蓝紫色
[0003] 现在，人们开始对革兰氏阳性菌进行快速检测技术的研宄以及各种生物学特征的 研宄，目前研宄主要集中在毒力调控机制、超抗原作用机制、耐药性、菌膜形成与感染等方 面，然而这些研宄的基础是进行基因组DNA的提取。因为革兰氏阳性菌其细胞壁较厚，基因 组DNA提取难度较大，费时较长。
[0004] 有效的提取革兰氏阳性菌基因组DNA，能够为进行基因分析与基因克隆提供重要 保证，从而丰富基因组学的研宄内容。因此，研制一种适用于革兰氏阳性菌基因组DNA提取 的，方便、快捷、实用的方法，解决使用常规方法提取革兰氏阳性菌基因组DNA样品所需提 取时间长的问题，意义重大。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种方便、快捷、实用的基于磁珠法快速提取革兰氏阳性 菌基因组DNA的方法，解决使用常规方法提取革兰氏阳性菌基因组DNA所需提取时间长的 问题。
[0006] 为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
[0007] 一种基于磁珠法快速提取革兰氏阳性菌基因组DNA的方法，包括革兰氏阳性菌细 胞的破碎，DNA的游离与杂蛋白的抽除，磁珠法快速纯化基因组DNA，所述方法具体包括以 下步骤：
[0008] 1)革兰氏阳性菌细胞的破碎：取3ml革兰氏阳性菌过夜培养液到离心管中， 10000_13000rpm/min离心l_5min后弃上清，往菌体沉淀中加入0. 2-0. 5ml双蒸水悬浮 沉淀，并加入50-80 μ 1工作液A，于40°C保温10_50min，然后加入30-60 μ 1工作液B和 5-10 μ 1工作液C，混合均匀后于37°C保温30-60min，然后加入0. 4-0. 6ml工作液D，混合均 匀；
[0009] 2)DNA的游离与杂蛋白的抽除：在步骤1)得到的混合液中加入200-600 μ 1工作 液E抽提，然后10000-13000rpm/min离心10_30min，取一次上清液至灭菌的I. 5ml离心管 中，加入200-600 μ 1工作液F抽提，然后10000-13000rpm/min离心10-30min，取二次上清 液至无菌的I. 5ml离心管中；
[0010] 3)磁珠法快速纯化基因组DNA :往含有二次上清液的离心管中加入与二次上清液 等体积的工作液G，震荡10-30s后，室温放置Ι-lOmin，然后将离心管放在磁力架上，进行磁 珠分离，待磁珠吸附到离心管一侧时吸去液体，保留磁珠，然后往含有磁珠的离心管中加入 0. 5-1. 5ml工作液H，打匀后室温静置5-10min，然后将离心管放在磁力架上，进行磁珠分 离，待磁珠吸附到离心管一侧时吸去液体，吸去液体，保留磁珠，然后往含有磁珠的离心管 中加入30-60 μ 1工作液I，将离心管放在磁力架上，进行磁珠分离，待磁珠吸附到离心管一 侧时吸取液体，此液体即为革兰氏阳性菌基因组DNA ;后续于1 %琼脂糖凝胶中电泳检测；
[0011] 所述工作液A为10-50mg/ml溶菌酶；
[0012] 所述工作液B为质量浓度10-20 %十二烷基硫酸钠（SDS);
[0013] 所述工作液C为20-50mg/ml蛋白酶K ;
[0014] 所述工作液D为4-6mol/L氯化钠（Nacl);
[0015] 所述工作液E是体积比为酷：氯仿：异戊醇=25:24:1的混合液；
[0016] 所述工作液F是体积比为氯仿：异戊醇=24:1的混合液；
[0017] 所述工作液G是体积比为异丙醇：磁珠混悬液=24:1的混悬液，所述磁珠混悬液 由磁珠和水按照体积比1:2混合配置而成，所述磁珠为硅基生物磁珠，粒径为lum，购买自 温州安科纳米科技有限公司，产品编号：AK1-G1000 ;
[0018] 所述工作液H由终浓度4. 3-21. 4mmol/L三羟甲基氨基甲烷（Tris),终浓度 2. 1-4. 2mmol/L乙二胺四乙酸（EDTA)，终浓度42. 9-85. 7mmol/L Nacl和体积终浓度 60-80 %无水乙醇组成；
[0019] 所述工作液I为5-10mmol/L三羟甲基氨基甲烷（Tris)，pH = 7. 0-9. 0。
[0020] 本发明所述终浓度是指溶液在工作液中的终浓度，例如所述工作液H由终浓度 4. 3-21. 4mmol/L三羟甲基氨基甲烷（Tris),终浓度2. 1-4. 2mmol/L乙二胺四乙酸（EDTA)， 终浓度42. 9-85. 7mmol/L NaCl和体积终浓度60-80%无水乙醇组成，是指Tris在工作液H 中的浓度为4. 3-21. 4mmol/L，EDTA在工作液H中的浓度为2. 1-4. 2mmol/L，NaCl在工作液 H中的浓度为42. 9-85. 7mmol/L，无水乙醇在工作液H中的体积终浓度为60-80%。
[0021] 进一步，所述工作液A为20mg/ml溶菌酶。
[0022] 进一步，所述工作液B为质量浓度10 %十二烷基硫酸钠。
[0023] 进一步，所述工作液C为20mg/ml蛋白酶K。
[0024] 进一步，所述工作液H由终浓度8. 6mmol/L三羟甲基氨基甲烷Tris,终浓度 3. 4mmol/L乙二胺四乙酸，终浓度60mmol/L Nacl和体积终浓度70%无水乙醇组成。
[0025] 进一步，所述工作液I为8mmol/L三轻甲基氨基甲烧，pH = 8. 0。
[0026] 本发明采用以上技术方案，使用工作液E以及工作液F去除细胞溶液中的蛋白等 杂质，以获得纯度较高的革兰氏阳性菌基因组DNA。常规的革兰氏阳性菌基因组DNA提取 方法主要是利用无水乙醇低温沉淀基因组，往往需要耗时IOh以上，而本发明基于磁珠法 提取革兰氏阳性菌基因组DNA，硅基磁珠表面固定有亲水性阴离子交换剂，可以特异的吸 附带负电的基因组DNA分子，而对其他生物材料基本不吸附，磁珠具有磁性，可以被磁铁吸 附，通过磁力架可以将附有基因组DNA的磁珠吸附在离心管壁上，可以保障最大程度地回 收样品中的核酸，同时去除其他杂质，整个提取过程仅需要不到2h的时间即可实现。
[0027] 与常规的革兰氏阳性菌基因组DNA提取方法相比，本发明不仅节省了大量提取时 间，同时简化了实验步骤，能够更有效、快速、经济地提取到革兰氏阳性菌基因组DNA。
【附图说明】
[0028] 图1为本发明方法提取的革兰氏阳性菌基因组DNA的电泳检测图：泳道1，2,3分 别是提取的葡萄球菌，链球菌，放线菌基因组DNA ;泳道4为TAKARA公司的DL4500Marker。
【具体实施方式】
[0029] 一种基于磁珠法快速提取革兰氏阳性菌基因组DNA的方法，包括革兰氏阳性菌细 胞的破碎，DNA的游离与杂蛋白的抽除，磁珠法快速纯化基因组DNA，所述方法具体包括以 下步骤：
[0030] 1)革兰氏阳性菌细胞的破碎：取3ml革兰氏阳性菌过夜培养液到离心管中，每 次10000-13000rpm/min离心l_5min后弃上清，往菌体沉淀中加入0. 2-0. 5ml双蒸水悬浮 沉淀，并加入50-80 μ 1工作液A，于40°C保温10_50min，然后加入30-60 μ 1工作液B和 5-10 μ 1工作液C，混合均匀后于37°C保温30-60min，然后加入0. 4-0. 6ml工作液D，混合均 匀；
[0031] 2)DNA的游离与杂蛋白的抽除：在步骤1)得到的混合液中加入200-600 μ 1工作 液E抽提，然后10000