60%无水乙醇组成；
[0070] 所述工作液I为5mmol/L三羟甲基氨基甲烷（Tris)，pH = 9. 0。
[0071] 实施例3
[0072] -种基于磁珠法快速提取革兰氏阳性菌基因组DNA的方法，具体包括以下步骤：
[0073] 1)革兰氏阳性菌细胞的破碎：取Iml放线菌过夜培养液到1.5ml离心管中， 13000rpm/min离心2min后弃上清，往离心管中再加入Iml放线菌过夜培养液，13000rpm/ min离心2min后弃上清，往离心管中中再加入Iml放线菌过夜培养液，13000rpm/min离心 2min后弃上清，（即总共是取3ml放线菌过夜培养液，分3次加到加到I. 5ml离心管中，每 次13000rpm/min离心2min后弃上清），然后往菌体沉淀中加入0. 5ml双蒸水悬浮沉淀，并 加入80 μ 1工作液A，于40°C保温50min，然后加入60 μ 1工作液B和10 μ 1工作液C，混合 均匀后于37°C保温45min，然后加入0. 6ml工作液D，混合均匀；
[0074] 2)DNA的游离与杂蛋白的抽除：在步骤1)得到的混合液中加入600 μ 1工作液E 抽提，然后13000rpm/min离心20min，取一次上清液至灭菌的I. 5ml离心管中，加入600 μ 1 工作液F抽提，然后13000rpm/min离心20min，取二次上清液至无菌的I. 5ml离心管中；
[0075] 3)磁珠法快速纯化基因组DNA :往含有二次上清液的离心管中加入与二次上清 液等体积的工作液G，震荡30s后，室温放置10min，然后将离心管放在磁力架上，进行磁 珠分离，待磁珠吸附到离心管一侧时吸去液体，保留磁珠，然后往含有磁珠的离心管中加 入I. 5ml工作液H，打匀后室温静置10min，然后将离心管放在磁力架上，进行磁珠分离，待 磁珠吸附到离心管一侧时吸去液体，吸去液体，保留磁珠，然后往含有磁珠的离心管中加入 60 μ 1工作液I，将离心管放在磁力架上，进行磁珠分离，待磁珠吸附到离心管一侧时吸取 液体，此液体即为放线菌基因组DNA ;后续于1 %琼脂糖凝胶中电泳检测；
[0076] 所述工作液A为50mg/ml溶菌酶；
[0077] 所述工作液B为质量浓度20 %十二烷基硫酸钠（SDS);
[0078] 所述工作液C为50mg/ml蛋白酶K ;
[0079] 所述工作液D为6mol/L氯化钠（Nacl);
[0080] 所述工作液E是体积比为酷：氯仿：异戊醇=25:24:1的混合液；
[0081] 所述工作液F是体积比为氯仿：异戊醇=24:1的混合液；
[0082] 所述工作液G是体积比为异丙醇：磁珠混悬液=24:1的混悬液，所述磁珠混悬液 由磁珠和水按照体积比1:2混合配置而成；
[0083] 所述工作液H由终浓度21. 4mmol/L三羟甲基氨基甲烷（Tris)，终浓度4. 2mmol/ L乙二胺四乙酸（EDTA)，终浓度85. 7mmol/L Nacl和体积终浓度80%无水乙醇组成；
[0084] 所述工作液I为lOmmol/L三羟甲基氨基甲烷（Tris)，pH = 7. 0。
[0085] 图1为实施例1的方法提取的革兰氏阳性菌基因组DNA的电泳检测图：其中，泳道 1为提取的葡萄球菌基因组DNA的试验结果；泳道2为提取的链球菌基因组DNA的试验结 果；泳道3为提取的放线菌基因组DNA的试验结果；泳道4为TAKARA公司的DL4500Marker。 从图1可看出本发明方法可以快速地提取到革兰氏阳性基因组DNA。
[0086] 提取到的革兰氏阳性菌基因组DNA，其纯度用OD26toZOD28tol比值来衡量，纯度见表 1〇
[0087] 表1革兰氏阳性菌DNA的纯度
[0088]
【主权项】
1. 一种基于磁珠法快速提取革兰氏阳性菌基因组DNA的方法，包括革兰氏阳性菌细胞 的破碎，DNA的游离与杂蛋白的抽除，磁珠法快速纯化基因组DNA，其特征在于：所述方法具 体包括以下步骤： 1) 革兰氏阳性菌细胞的破碎：将革兰氏阳性菌过夜培养液加入离心管中， 10000-13000rpm/min离心l-5min后弃上清，每3ml革兰氏阳性菌过夜培养液对应的菌体 沉淀中加入0.2-0.51111双蒸水和50-80以1工作液4，于40°(：保温10-501^11，然后加入 30-60 μ 1工作液B和5-10 μ 1工作液C，混合均匀后于37° C保温30-60min，然后加入 0.4-0.6ml工作液D，混合均匀； 2. DNA的游离与杂蛋白的抽除：在步骤1)得到的混合液中加入200-600 μ 1工作 液Ε，然后10000-13000rpm/min离心10-30min，取一次上清液至灭菌的离心管中，加入 200_600 μ1工作液F，然后10000-13000rpm/min离心10_30min，取二次上清液至无菌的 离心管中； 3) 磁珠法快速纯化基因组DNA :往含有二次上清液的离心管中加入与二次上清液等 体积的工作液G，震荡10-30s后，室温放置Ι-lOmin，然后将离心管放在磁力架上，进行磁 珠分离，待磁珠吸附到离心管一侧时吸去液体，保留磁珠，然后往含有磁珠的离心管中加入 0. 5-1. 5ml工作液H，打匀后室温静置5-10min，然后将离心管放在磁力架上，进行磁珠分 离，待磁珠吸附到离心管一侧时吸去液体，吸去液体，保留磁珠，然后往含有磁珠的离心管 中加入30-60 μ 1工作液I，将离心管放在磁力架上，进行磁珠分离，待磁珠吸附到离心管 一侧时吸取液体，此液体即为革兰氏阳性菌基因组DNA ; 所述工作液A为10-50 mg/ml溶菌酶； 所述工作液B为质量浓度10-20%十二烷基硫酸钠； 所述工作液C为20-50mg/ml蛋白酶K ; 所述工作液D为4-6mol/L氯化钠； 所述工作液E是体积比为酚：氯仿：异戊醇=25:24:1的混合液； 所述工作液F是体积比为氯仿：异戊醇=24:1的混合液； 所述工作液G是体积比为异丙醇：磁珠混悬液=24:1的混悬液，所述磁珠混悬液由磁珠 和水按照体积比1:2混合配置而成； 所述工作液H由终浓度4. 3-21. 4 mmol/L三羟甲基氨基甲烷，终浓度2. 1-4. 2 mmol/ L乙二胺四乙酸，终浓度42. 9-85. 7 mmol/L Nacl和体积终浓度60-80%无水乙醇组成； 所述工作液I为5-10mmol/L三羟甲基氨基甲烷，pH=7. 0-9. 0。
2. 根据权利要求1所述的一种基于磁珠法快速提取革兰氏阳性菌基因组DNA的方法， 其特征在于：所述工作液A为20 mg/ml溶菌酶。
3. 根据权利要求1所述的一种基于磁珠法快速提取革兰氏阳性菌基因组DNA的方法， 其特征在于：所述工作液B为质量浓度10%十二烷基硫酸钠。
4. 根据权利要求1所述的一种基于磁珠法快速提取革兰氏阳性菌基因组DNA的方法， 其特征在于：所述工作液C为20mg/ml蛋白酶K。
5. 根据权利要求1所述的一种基于磁珠法快速提取革兰氏阳性菌基因组DNA的方 法，其特征在于：所述工作液H由终浓度8. 6 mmol/L三羟甲基氨基甲烷Tris，终浓度3. 4 mmol/L乙二胺四乙酸，终浓度60mmol/L Nacl和体积终浓度70%无水乙醇组成。
6.根据权利要求1所述的一种基于磁珠法快速提取革兰氏阳性菌基因组DNA的方法， 其特征在于：所述工作液I为8mmol/L三羟甲基氨基甲烷，pH=8. 0。
【专利摘要】本发明公开了一种基于磁珠法快速提取革兰氏阳性菌基因组DNA的方法，包括革兰氏阳性菌细胞的破碎，DNA的游离与杂蛋白的抽除，磁珠法快速纯化基因组DNA三个步骤，与常规的革兰氏阳性菌基因组DNA提取方法相比，本发明不仅节省了大量提取时间，同时简化了实验步骤，能够更有效、快速、经济地提取到革兰氏阳性菌基因组DNA。
【IPC分类】C12R1-46, C12R1-44, C12N15-10
【公开号】CN104560952
【申请号】CN201410834847
【发明人】王清水, 余彦
【申请人】福建师范大学
【公开日】2015年4月29日
【申请日】2014年12月29日