先天性白内障pitx3基因新突变的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及疾病相关突变基因领域，特别是遗传疾病基因突变，先天性白内障相 关基因突变。
【背景技术】
[0002] 任何因素引起的晶状体混浊使其透明性下降都可以称为白内障（cataract)，估 计全球约25 %的人患有白内障，大多数人晶状体混浊较少，没有明显地影响视力。但白内障 仍是全球第一位致盲的眼病，每年新增加的白内障盲人或视残患者有125万人。白内障根 据发病年龄分为先天性白内障（congenital cataract, CC)和老年性白内障（age-related cataract)。先天性白内障是指出生前即存在、或出生后逐渐形成的在出生后一年内发生的 晶体部分或全部混浊。虽然先天性白内障不如老年性白内障常见，可它却是儿童常见的眼 病，在我国新生儿中患病率为0.01%-0.06%，占儿童致盲眼病的第2位。先天性白内障 由于在胚胎期晶状体代谢异常而导致其自身透明度下降，任何参与、影响晶状体发育的基 因突变都可能导致先天性白内障的发生。
[0003] 先天性白内障既可独立发病，也可作为眼部或全身其它系统先天性病变综合征的 一部分，发病机制十分复杂，其中约1/3为遗传性因素。绝大多数先天性白内障是单基因 遗传病，其遗传方式包括常染色体显性遗传 （autosomal dominant congenital cataract， ADCC)，常染色体隐性遗传 （autosomal recessive congenital cataract，ARCC)和 X 连锁 遗传（X-linked congenital cataract，XLCC)三种。其中以ADCC最为常见，夕卜显率高，研 宄相对集中。此外，少数先天性白内障可能与染色体结构异常或线粒体病有关。
[0004] 随着分子遗传学的发展，迄今为止已报道了 26个基因及超过40个基因位点与先 天性白内障发病相关。包括晶状体蛋白（CRYAA，CRYAB，CRYBA1/A3, CRYBBl，CRYBB2, CRYGC， CRYGD)、缝隙连接蛋白（GJA8，GJA3)、主要内源性蛋白（MIP)、细胞骨架蛋白（BFSP2)和转录 因子（PITX3, HSF4 和 MAF)等。
[0005] 先天性白内障因晶状体混浊的部位、形态和程度不同，形态学表现各异。常见的有 绕核性白内障（perinuclear cataract)又称板层白内障（lamellar cataract)、核性白内 障（nuclear cataract)、前极白内障（anterior pole cataract)、后极白内障（posterior polecataract)、粉尘状白内障（pulverulent cataract)、点状白内障（punctate cataract)、膜性白内障（membrane cataract)、盘状白内障（disciform cataract、Coppock cataract)、缝状白内障（sutural catatract)、珊瑚状白内障（coralline cataract)、花 冠状白内障（coronal cataract)以及全白内障（total cataract)等表型。资料显示先天 性白内障具有高度的遗传异质性：表型相同的先天性白内障可能是由不同基因突变或相同 基因的不同突变造成的，而同一基因的相同或不同突变可有不同的临床表现，可能与其它 修饰基因或环境因素有关。先天性白内障表型和基因型的关系，至今仍不明确。还有许多 定位后未发现致病基因和许多候选基因没有在人类得到证实。
[0006] 由于先天性白内障在早期即可以发生剥夺性弱视，因此其治疗又不同于一般成人 白内障。目前对该病的治疗以手术为主，虽然手术的方式和技巧在不断的改进，但由于儿童 的眼睛结构解剖特点和对手术的反应情况与成人有很大差别，手术并发症和后遗症的机率 要高得多。例如：后发性白内障，晶体瞳孔夹持，继发性青光眼等，且术后不可逆性弱视、无 晶体眼高度远视的屈光状态和人工晶体眼无调节的屈光状态都对患者有很大的影响，而且 手术治疗，费用昂贵。因此先天性白内障的治疗仍是眼科的难题。通过先天性白内障致病 机制的研宄，寻找基因突变中的致病机理，探索一种简捷有效的药物治疗途径，攻克人类第 一大眼病，对人类意义重大。
[0007] 全外显子组测序是利用特制的DNA序列探针将全基因组中的外显子区域捕获下 来，然后针对每个外显子进行深度测序的技术，与传统的连锁分析、候选基因关联分析技术 相比，外显子组测序技术针对基因组内编码蛋白质的外显子区域，目标集中，测序深度和精 度更高。2009年，美国Sarah B Ng等人利用外显子组测序成功定位出mile综合症的基因 DHODH。我国Wang等人利用外显子组测序发现了小脑共济失调的新的突变基因 TGM6。近 期，随着外显子组测序技术的广泛应用，一批新的致病突变基因被相继发现，极大地推动了 相关疾病及治疗措施的研宄进展。
[0008] 确定新的先天性白内障相关基因的致病突变，对开展先天性白内障的分子诊断具 有重要意义。
【发明内容】
[0009] 本发明采用新一代的全外显子组测序技术，针对一个中国汉族常染色体显性遗传 的先天性白内障患病家系进行了全部外显子区域的高通量测序，结合生物信息分析发现 PITX3基因上的c.608delC(p.A203fS)突变与先天性白内障（CC)有关，并通过共分离实验 等方法验证了这一变异，将会为CC发病机制的研宄奠定重要基础，也有可能为CC患者治疗 提供全新的理论依据，丰富和完善CC疾病的诊断流程，从而对CC患者的临床诊断提供更多 的支持和参考，为开发有效的早期致病基因筛查和干预治疗措施提供科学依据。
[0010] 因此，本发明涉及先天性白内障基因的突变，具体为：PITX3基因上的c.608delC/ р. A203fs〇
[0011] 在第一方面，本发明涉及先天性白内障的生物标记物，即PITX3的突变，所述生物 标记物是具有如下的突变PITX3基因或蛋白：c. 608delC/p. A203fs。
[0012] 在一个实施方案中，本发明的突变PITX3基因为具有以下突变的SEQ ID NO:3 : с. 608delC，突变的PITX3基因的cDNA编码区序列为SEQIDN0:3的序列表示。
[0013] 在一个实施方案中，本发明的突变PITX3蛋白为具有以下突变的SEQ ID N0:4: р. A203fs，突变的PITX3蛋白为SEQ ID N0:4的序列表示。
[0014] 在一个实施方案中，本发明还涉及包含突变PITX3基因的构建体或重组细胞，所 述突变是：c. 608delC，例如所述突变PITX3基因为SEQ ID NO:3。
[0015] 在第二方面，本发明涉及一种检测先天性白内障的方法，所述方法包括检测受试 者的PITX3基因或蛋白中是否存在突变位点，如果有突变位点，则所述受试者被鉴定为 患有先天性白内障，或者其后代会患有先天性白内障或易患先天性白内障，所述突变为 с. 608delC/p. A203fs〇
[0016] 在一个实施方案中，PITX3基因的cDNA编码区序列为SEQ ID NO: 1的序列表示， 突变的PITX3基因的cDNA编码区序列为SEQ ID N0:3的序列表示。
[0017] 在一个实施方案中，PITX3蛋白为SEQ ID NO:2的序列表示，突变的PITX3蛋白为 SEQ ID NO:4的序列表示。
[0018] 在一个实施方案中，本发明的检测先天性白内障的方法包括如下引物扩增的步 骤：
[0019] SEQ ID NO:5 和 SEQ ID NO:6 ;
[0020] 在一个实施方案中，本发明的检测先天性白内障的方法中检测突变位点通过选自 如下的技术进行：测序、电泳、核酸杂交、PCR、逆转录酶链反应和变性高效液相色谱，基于荧 光标记技术的DNA测序。
[0021] 在本发明第二方面的方法中，优选检测PITX3基因的突变c. 608delC (即PITX3蛋 白的突变P.A203fs)。
[0022] 在第三方面，本发明涉及一种突变PITX3基因的筛选系统，所述筛选系统包括检 测受试者的PITX3基因（蛋白）中是否存在PITX3基因的突变c.608delC(即蛋白的突变 p. A203fs)〇
[0023] 在一个实施方案中，PITX3基因为SEQ ID N0:1的序列表示，突变的PITX3基因的 cDNA编码区