表达猪瘟病毒e2蛋白重组prrs病毒基因工程疫苗的构建方法和应用
【专利说明】表达猪瘟病毒E2蛋白重组PRRS病毒基因工程疫苗的构建 方法和应用
【背景技术】：
[0001] 本发明属于生物工程领域，具体地说，涉及一种病毒的重组质粒和基因工程疫苗， 更具体地说，涉及一种能够表达CSFV E2蛋白的PRRS病毒重组质粒和基因工程疫苗。
[0002] 猪繁殖与呼吸综合征（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome，PRRS) 是一种严重影响养猪业的接触性传染病，给世界各国造成的经济损失巨大。其病原PRRSV 一直处于不断的变异及进化过程中。目前，反向遗传操作被广泛应用于研究PRRSV的生物 学特性、致病机理、毒力决定因子以及不断变异的分子机制，而其基因组作为外源基因表达 载体的研究也被广泛开展。PRRSV的基因组中除ORFl和0RF2以及0RF4和0RF5外，具结构 蛋白编码框架之间有少则几个多则逾百的碱基重叠（overlap)。相关研究表明：0RF重叠区 的影响会导致嵌合病毒失去感染性，因此可选择非重叠区或者将重叠区拉开作为外源基因 的插入位点。需要注意的是外源基因的插入原则应以能在最小程度上改变病毒基因组为基 础。但即便如此，插入外源基因也会在传代过程中逐渐丢失编码序列以致无法发挥其功能。 呈现遗传不稳定性。Dr. Dongwan Yoo 2009年报道了其在ORFlb和0RF2之间插入了 GFP基 因，如果在其3'端下游插入一个二级结构简单的（由其自身及周围序列形成）转录调控序 列6(TRS6)的拷贝，让外源基因的表达被一个独立的转录子所引导。所构建的突变体克隆 能够在至少37代次的传达过程中保遗传稳定。Dr. Chengbao Wang的研究则表明TRS6拷贝 的插入同样能够使在其他位点插入的外源序列稳定。
[0003] 猪瘟病毒（CSFV)的囊膜糖蛋白E2(gp55)基因编码的蛋白具有很强的免疫原 性，能够诱导产生中和抗体，是引起动物机体产生保护性免疫的主要抗原蛋白。目前已被 批准生产的猪癌标记疫苗是 Advasure(Pfizer，UK)和 Porcilis Pesti (Intervet，the Netherlands)二者均是以猪瘟病毒E2蛋白为基础开发的亚单位疫苗。
[0004] 猪繁殖与呼吸综合征（PRRS)和猪瘟（CSF)都是临床上非常重要的猪传染病，本发 明旨在高致病性PRRSV细胞致弱疫苗株HuM-Fl 12的全长感染性克隆骨架上，插入CSFV的 E2基因，获得能够稳定表达E2蛋白的重组PRRS病毒，对其进行一系列病毒特性分析及遗传 稳定性检测；并在病毒复制、转录、翻译水平对其与亲本病毒进行比较分析。继而在动物体 内进行免疫保护性试验以评估其作为疫苗候选株的可行性。因为临床上PRRSV和CSFV两 种单苗使用不当会有干扰，而本研究中获得的重组疫苗可以回避这种干扰，达到"一针防两 病"的效果。
【发明内容】
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[0005] 本发明的目的在于，提供一种表达猪瘟E2基因的猪繁殖与呼吸综合征病毒重组 质粒的构建方法。
[0006] 本发明的构建表达猪瘟E2基因的猪繁殖与呼吸综合征病毒嵌合重组质粒的方 法，为根据猪瘟石门株和猪瘟兔化弱毒株C株的E2基因，以及高致病性猪繁殖与呼吸综合 征病毒细胞致弱疫苗株HuN4-F112的基因序列设计SOE PCR引物，在HuN4-F112的ORFlb 和0RF2之前插入CSFV的E2基因，并在外源基因 3'端下游插入此病毒的转录调控序列 6 (TRS6)。将扩增出的两个嵌合E2片段通过Asc I和EcoR V双酶切，然后回收PCR产物连 接到HuN4-F112的Asc I和EcoR V双酶切载体上，从而获得了两个嵌合重组质粒pA-SM-E2 和 pA_C_E2。
[0007] 本发明的嵌合CSFV E2的PRRSV的基因工程活疫苗候选株，是能够稳定表达CSFV 石门株E2蛋白的高致病性PRRSV细胞传代致弱株HuM-Fl 12嵌合重组弱毒疫苗株。
[0008] 本发明的表达CSFV石门株E2的PRRSV基因工程活疫苗的构建方法包括以下步 骤：首先通过SOE PCR的方法扩增出含有CSFV石门株E2的PRRSV突变片段，然后将扩增出 的PCR片段和高致病性PRRSV细胞传代致弱疫苗株HuM-Fl 12进行Asc I和EcoR V酶切， 最后将酶切后的突变PCR片段和HuM-Fl 12的双酶切片段进行连接，并转化TOPlO感受态 细胞，然后通过筛选获得基因工程活疫苗VA-SM-E2,从而提供了相应的构建方法。
[0009] 本发明同时提供一种猪瘟E2基因的猪繁殖与呼吸综合征病毒嵌合疫苗的制备方 法，所述方法按以下步骤进行：（1)制苗用细胞的传代与培养：将Marcl45或MA104细胞系 经EDTA胰酶细胞分散液消化传代，以细胞生长液继续培养，形成单层时，备用；（2)细胞毒 种的繁殖：将病毒液按1/10的体积量接入已经生长成良好细胞单层的细胞瓶，吸附1小时 后，加入细胞维持液于细胞系单层，继续培养，当70-80%细胞出现病变后收获，收获的毒液 冻融2-3次后置-15°C以下保存，取少量做半成品检验；（3)配苗、分装及冻干：将检验合格 的病毒培养液，与常规稳定剂按1 : 1的体积比在一容器内混合，充分摇勻，定量分装；每头 份含细胞毒液不少于1〇5_ tlTCID5tl，分装后进行冷冻干燥即得成品。
[0010] 使用本发明所构建的重组质粒PA-SM-E2和PA-C-E2,转染MARC-145细胞后所拯 救出来的病毒具有和亲本病毒vHuN4-F112相似的病毒生物学特性。并且在至少连续20代 次的传代过程中能够保持遗传稳定性。同时，基于上述重组质粒，构建的一株嵌合重组疫苗 株VA-SM-E2对猪体具有较好的安全性，免疫后可有效诱导机体产生免疫应答，不仅能够产 生高水平的与亲本疫苗相似的PRRSV N蛋白抗体，而且能够产生显著的抗CSFV E2的抗体 水平，这些抗体在免疫猪体七天后即可以产生，在28天-35天左右抗体水平达到峰值，具有 良好的免疫效果。
【附图说明】
[0011] 图1是CSFV E2嵌合重组质粒构建示意图
[0012] 图2是SOE PCR引物扩增CSFV石门株E2和CSE2基因不同的PCR片段的电泳检 测结果，其中，图2a为由pHuN4-F112为模板，引物HF11559和CSFV-E2-R1获得的长度约为 450bp的PCR产物S0E-1和以pHuN4-F112为模板，引物CSFV-E2-F4和HR13090获得的长度 约为I IOObp的PCR片段S0E-4 ;图2b为由石门株和C株猪瘟病毒cDNA为模板，CSFV-E2-F2 和CSFV-E2-R2/R3为上下游引物所获得的1200bp的PCR产物S0E-2 ;图2c为以S0E-1和 S0E-2回收产物为模板，引物HF11559和CSFV-E2-R2/R3为引物扩增出的1650bp长度的 PCR产物；图2d为由S0E-3和S0E-4的回收产物为模板，引物HF11559和HR13090扩增出 的2750bp长度的PCR产物S0E-5 ;图2e为由S0E-5的EcoR V和Asc I双酶切电泳结果。
[0013] 图3a是构建好的嵌合重组质粒pA-SM-E2、pA-C-E2以及亲本质粒pHuN4-F112的 EcoR V和Asc I双酶切鉴定结果，图3b是对嵌合重组质粒的Swa I线性化电泳结果，图3c 是对线性化模板的体外转录RNA的电泳鉴定。
[0014] 图4是Kas I酶切嵌合重组质粒pA-SM-E2、pA-C-E2以及亲本质粒pHuN4-F112的 电泳结果，其中，泳道1是Kas I酶切的pA-SM-E2，泳道2是Kas I酶切的pA-C-E2，泳道3是 Kas I 酶切的阳性对照pHuN4-F112,泳道4 是Marker DL2,000,泳道 5 是Marker DL15,000。
[0015] 图5是用重组质粒转染细胞后出现的细胞病变结果。
[0016] 图6是拯救病毒的N蛋白和CSFV E2蛋白的免疫荧光照片，其中，A是被拯救病毒 VA-SM-E2P20代的N蛋白、CSFV E2蛋白免疫荧光照片以及细胞核染图片；B是被拯救病毒 VA-C-E2 P20代的N蛋白、CSFV E2蛋