白免疫荧光照片以及细胞核染图片；C是vHuN4-F112 的N蛋白、CSFV E2蛋白免疫荧光照片以及细胞核染图片；D为阴性对照。
[0017] 图7是对拯救病毒株与野毒株病毒滴度比较结果，生长曲线的描绘。
[0018] 图8是试验及对照组猪在表达CSFV E2重组病毒株VA-SM-E2病毒免疫接种后每 天的体温变化。
[0019] 图9是在￥六-51\^2和￥!111财-卩112株病毒接种后第0,7，14,21，28,35,42,49天的 PRRSV N蛋白抗体变化图。
[0020] 图 10 是在 VA-SM-E2 和 vHuN4-F112 株病毒接种后第 0,7,14,21，28,35,42,49 天 的CSFV E2蛋白抗体变化图。
[0021] 图11是在￥八-51^2和￥!111财4112株病毒接种后第7，14,21，28天的血清病毒载 量变化图。
【具体实施方式】
[0022] 在本发明中，所述嵌合重组质粒指的是，利用反向遗传操作技术，将CSFV石门株 和C株E2基因插入HuN4-F112基因组骨架中所获得的pA-SM-E2和pA-C-E2。
[0023] 在本发明中，所述嵌合重组病毒指的是，利用基因嵌合技术获得的全长重组质粒 PA-SM-E2和pA-C-E2转染MARC-145细胞后拯救出的活病毒。
[0024] 在本发明中，所述的反向遗传操作指的是：相对于经典遗传学而言的，是在获得的 高致病性PRRSV细胞致弱毒株HuM-Fl 12的感染性克隆骨架上，通过SOE PCR的方法或者 定点突变的方法对病毒基因进行必要的加工和修饰，进行外源基因的插入，再按组成顺序 构建全长病毒基因组，让其装配出具有生物活性的病毒粒子，研究突变病毒与亲本病毒在 病毒生物学特性上的变化，以及外源基因插入可能对病毒的表型、性状有何种影响等方面 的内容。
[0025] 在本发明中，所述高致病性PRRSV细胞致弱毒株HuN4-F112的Genbank登录号是 EF635006。
[0026] 在本发明中，所述细胞致弱毒株HuN4-F112指的是，参考文献Shanrui Zhang， Yanjun Zhou，Yifeng Jiang，Guoxin Li,Liping Yan，Hai Yu,Guangzhi Tong. Generation of an infeetious clone of HuN4_F112， an attenuated live vaccine strain of porcine reproductive and respiratory syndrome virus 的方法所构建的感染性克隆。
[0027] 以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本 发明而非用于限定本发明的范围。
[0028] 下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如《分子克隆：实 验室手册》(New York :Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件进行。
[0029] 在本发明的实施例中，使用的病毒和细胞：MARC_145细胞（非洲绿猴肾细胞系）
[0030] 在本发明的实施例中，使用的质粒与菌株：pBlueSCript II SK(+)载体购自 Invitrogen公司，pBS-T载体、T0P10感受态细胞购白TIANGENE公司。
[0031] 在本发明的实施例中，使用的其他试剂：QIAamp Viral RNA Mini Kit购 自 QIAGENE 公司，pfu II DNA Polymerase 购自 Strategene 公司，T7 mMESSAGE High Yield Capped RNA Transcription Kit 购自 Ambion 公司，胶回收试剂盒和 Quant ReverseTranscriptase购自TIANGENE公司，rTaq DNA聚合酶，dNTP和限制性内切酶购自 TaKaRa公司，质粒提取试剂盒购自北京博大泰克生物基因技术有限责任公司，DMRIE-C转 染试剂购白Invitrogen公司，Opti-MEM购自Invitrogen公司。
[0032] 在本发明的实施例中，MRC-145单层细胞采用以下方法制备：
[0033] MARC-145细胞在含有10% FBS的DMEM培养基的六孔板中贴壁长满单层后，弃培 养基，PBS洗两遍后加入0. 01M0I的病毒500微升吸附1小时后，弃吸附液，PBS洗两遍后加 入维持液（2% FBS的DMEM)培养基，37 °C 5 % 0)2培养箱中培养。
[0034] 实施例1表达CSFV E2蛋白的嵌合重组质粒的构建
[0035] 根据GenBank登录号为EF635006和HM175885碱基序列，设计出6条引物，用来进 行SOE PCR扩增，过程如图2所示，然后分别通过细胞转染实验，验证了获得的嵌合重组质 粒的感染性，具体过程如下：
[0036] I. 1弓丨物设计
[0037] 根据GenBank登录号为EF635006的HuN4-F112的碱基序列和登录号为HM175885 的猪瘟病毒序列，设计SOE PCR引物，分别命名为：HF11559、HR13090、CSFV-E2-F2、 CSFV-E2-R1、CSFV-E2-F4、CSFV-E2-R2/R3,其序列分别如下所示：
[0038] HFl1559 -TCATACATCCGAGTTCCTGTT-3 ; SEQ ID NO. 1
[0039] HR13090：5/ -GAAATATTGTCATGGCGAGGC-3; SEQ ID NO. 2
[0040] CSFV-E2-F2 ：5 ; -TCATTGAACCAACTTTAGGCCTGAATTGAAatggcattcctcatctgcttg-3 ;SEQ ID NO. 3
[0041] CSFV-E2-R1 :5 ' -caagcagatgaggaatgccatTTCAATTCAGGCCTAAAGTT-3 ' SEQ ID NO. 4
[0042] CSFV-E2-F4 :5 ' -cagattacttcgcagaattttgaGTTCCGTGGCAACCCCTTTAACCAGATG-3 ;SEQ ID NO. 5
[0043] CSFV-E2-R2/R3 :5， -CATTGTTCCGCTGAAACTCTGGTTAAAGGGGTTGCCACGGAACtcaaaatt Ctgcgaagtaatctg-S i SEQ ID NO. 6
[0044] 具体构建步骤如下：
[0045] I. I. 1 扩增 S0E-1PCR 产物
[0046] 以pHuN4-F112作为模板，引物HF11559和CSFV-E2-R1分别作为上游引物和下游 引物，PCR扩增突变片段S0E-1，具体如下：
[0047] PCR反应体系为：pHuM-Fl 12质粒模板1 μ L，上下游引物对（10 μ M)各1 μ L， IOXpfu Buffer5yL，2.5mM dNTP 4yL，pfu II Turbo DNA 聚合酶 5units，加水至 50yL。
[0048] PCR反应参数为：95°C预变性2min，95°C变性20s，60°C退火20s，72°C延伸15s，共 进行35个循环，然后72°C延伸3min。
[0049] 取PCR反应产物，用1. 2%琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图2a所示，根据检测结果， 获得的目的片段大小为450bp。
[0050] I. L 2 扩增 S0E-2PCR 产物
[0051] 以石门株和C株猪瘟病毒cDNA为模板，引物CSFV-E2-F2和CSFV-E2-R2/R3分别 作为上游引物和下游引物，PCR扩增S0E-2,具体如下：
[0052] PCR反应体系为：石门株和C株猪瘟病毒cDNAlyL，上下游引物对（10μΜ)各 lyL，10XpfuBuffer 5yL，2.5mM dNTP 2yL，pfu II Turbo DNA 聚合酶 5units，加水至 50 μ L0
[0053] P