一种β-葡萄糖苷酶及其制备方法与应用
【技术领域】
[0001]本发明属于基因工程技术及生物医药领域，具体涉及一种β-葡萄糖苷酶及其制备方法与应用，尤其是酶法转化多组分人参皂苷Rbl和Rb2制备人参皂苷Rd的应用。
【背景技术】
[0002]人参(Panax ginseng C.A.Meyer)是一种多年生五前科人参属药用植物，是我国传统名贵中药材，其显著的抗肿瘤、抗炎、抗衰老活性一直以来都是研宄的热点。随着现代分离和分析技术的进步，人参皂苷中的活性成分也得到了深入的解析，已分离鉴定的人参皂苷单体有50余种。
[0003]近年来，人参皂苷Rd因其独特的药理活性受到广泛的关注，其独特的肾脏保护功能和特异性阻断受体依赖性钙离子通道功能是其它单体所没有的，同时人参皂苷Rd还具有较强的促进神经干细胞分化和保护神经系统功能，除此之外，还具有治疗心血管疾病、炎症等功能。因此，开发一种高效专一、低成本且绿色的人参皂苷Rd生产工艺具有迫切的现实需要同时也具有重要的实际应用价值。
[0004]人参皂苷Rd相对于多组分人参皂苷(Rbl、Rb2、Rc、Re和Rgl)在人参中含量显著偏低，从人参中直接提取回收率低，无法应用于大规模生产；因其结构的复杂性，使得化学合成人参皂苷Rd更为困难，然而根据人参皂苷Rd在结构方面与多组分人参皂苷Rbl、Rb2的相比发现(图1)，它们都具有相同的达玛烷骨架，仅在碳20位相差一个糖基(吡喃葡萄糖基和阿拉伯吡喃糖基)。因此去除该20位的相应糖基即可得到所需产物人参皂苷Rd，而相比反应条件剧烈的物理及化学方法，生物酶法所适用的反应条件相对温和且高效专一，几乎不产生废弃物因此无污染，绿色环保。
[0005]针对目前已有的对转化人参皂苷Rd方面的研宄及相关专利，发现其中存在的局限有:(1)大部分生物转化人参皂苷所用方式是微生物转化，但微生物转化所得产物品质难以控制，对产品的纯度及得率有较大影响，而酶处理专一性强，副产物少，因此发掘单一高效的糖苷水解酶能达到提高产物得率及纯度的目的；(2)在利用生物酶转化制备人参皂苷Rd研宄中，可以通过β -葡萄糖苷酶催化人参皂苷Rbl来获得，但还没有通过微生物酶催化人参皂苷Rb2来获得，也没有发现能催化人参皂苷Rb2的β-葡萄糖苷酶。因此发掘高效转化人参皂苷Rb2的水解酶，特别是既能转化人参皂苷Rbl又能转化人参Rb2水解酶，对于制备人参皂苷Rd具有重大意义和应用前景。此外，提高制备Rd产量，对进一步转化Rd制备获得人参皂苷Rg3，Rh2和CK等更多活性物质也具有重要意义；(3)酶水解人参皂苷过程中的产物之一的葡萄糖对葡萄糖苷酶具有强烈的抑制作用，对酶活力有极大的影响，发掘耐糖能力优异的β -葡萄糖苷酶有利于提高酶催化的效率，该种性质对降低生产成本及能耗具有重要意义。
【发明内容】
[0006]解决的技术问题:本发明针对上述局限性，本申请人提供一种具有较高阿拉伯吡喃糖苷酶活力的β-葡萄糖苷酶及其制备方法与应用，并通过基因工程技术获得催化效率高，热稳定性优异，能耐受高温的重组β -葡萄糖苷酶TPEBGL1，该重组酶TPEBGL1对人参皂苷Rbl和Rb2都具有较强的催化能力。同时，能耐受较高浓度的葡萄糖。因而可降低产物反馈抑制对酶活力的影响，此外，还创立了一种不需IPTG诱导即可高效表达该重组酶TPEBGLI的酶制备方法，因此通过TPEBGL1转化制备人参皂苷Rd的方法是一种高效、便捷的方法。
[0007]技术方案:一种β -葡萄糖苷酶，氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示。
[0008]编码所述β -葡萄糖苷酶的核苷酸，核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示。
[0009]所述β -葡萄糖苷酶的制备方法，将SEQ ID N0.2所示的DNA片段插入表达载体获得重组质粒，将重组质粒转化宿主菌，以及其诱导表达条件和后续目的蛋白的纯化。
[0010]所述制备方法步骤如下:
[0011]I)、以提取的 Thermotoga petrophila DSM 13995 基因组 DNA 为模板，用具有 SEQID N0:3所示的核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列的下游引物扩增，PCR扩增得到SEQ ID N0.2所示的DNA分子；
[0012]2)、将得到的DNA分子和pET_20b分别用Nde I和Xho I进行双酶切，连接得到含有β-葡萄糖苷酶的核苷酸序列的重组质粒；
[0013]3)、将步骤2)得到的重组质粒转化表达宿主菌JM109 (DE3)，不加IPTG于37°C下诱导表达，离心收集菌体，破碎菌体后经Ni2+亲和层析柱纯化即得。
[0014]包含所述β -葡萄糖苷酶的核苷酸片段的重组质粒。
[0015]所述β -葡萄糖苷酶在制备人参皂苷Rd中的应用。
[0016]—种通过所述β -葡萄糖苷酶转化人参皂苷Rbl和Rb2制备人参皂苷Rd的方法，所述β -葡萄糖苷酶在pH 4-8，温度30°C -95°C，酶解人参皂苷Rbl和Rb2制备得到人参皂苷Rd。pH优选为6.0，温度优选为90°C。
[0017]有益效果:
[0018](I)本发明所述β -葡萄糖苷酶热稳定性优异，能耐受高温；
[0019](2)本发明所述葡萄糖苷酶具有较高β_1，6-糖苷键水解能力同时具有较强的α -1，6-阿拉伯吡喃糖苷键水解能力，对人参皂苷Rbl和Rb2的转化能力强，本发明所述β -葡萄糖苷酶与人参皂苷Rbl和Rb2孵育一定时间后，检测到人参皂苷Rbl或Rb2几乎完全转化为人参皂苷Rd ;
[0020](3)本发明所述TPEBGL1的制备方法不需要诱导剂IPTG即可高效表达。
【附图说明】
[0021]为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
[0022]图1为本发明所述β -葡萄糖苷酶转化人参皂苷Rbl和Rb2生成人参皂苷Rd的水解线路图。
[0023]图2为实施例2纯化的葡萄糖苷酶的纯度鉴定结果图；其中泳道M为蛋白Marker (购自Thermo scientific公司，货号2661)，泳道I为纯酶蛋白；泳道2为诱导表达后全细胞裂解液；泳道3为PET-20b转化宿主菌空白对照的全细胞裂解液。
[0024]图3为实施例3本发明所述β-葡萄糖苷酶诱导表达结果图，其中纵坐标为相对酶活力，单位为％;横坐标为诱导条件的编号，其中1-6分别表示:1，37°C不加IPTG ;2，30°C不加 IPTG ;3，30°C 加 IPTG 至终浓度 0.0lmM ;4，30°C 加 IPTG 至终浓度 0.05mM ;5，30°C 加IPTG至终浓度0.1mM ;6，30°C加IPTG至终浓度0.5mM。
[0025]图4为实施例4本发明所述述β -葡萄糖苷酶的定性测定结果图，其中a为最适反应pH的测定结果图，横坐标为pH，纵坐标为相对酶活力，单位％ ;b为最适反应温度的测定结果图，横坐标为温度，单位摄氏度(°C)，纵坐标为相对酶活力，单位％ ;cSpH稳定性的测定结果图，横坐标为PH，纵坐标为相对酶活力，单位％ ;(1为温度稳定性的测定结果图，横坐标为保温时间，单位小时(min)，纵坐标为相对酶活力，单位％。
[0026]图5所示为实施例5本发明所述葡萄糖苷酶的耐糖系数Ki测定结果图。横坐标为反应体系中葡萄糖添加量，单位mM，纵坐标为相对酶活力，单位％。
[0027]图6系列所示实施例6不同反应时间下利用HPLC对人参皂苷Rbl和Rb2分别水解制备人参皂苷Rd转化情况进行检测的结果图，其中:
[0028]图6A为人参皂苷Rbl经TPEBGL1制备生成人参皂苷Rd的结果图；
[0029]图6B为不同反应时间下(0，10，20，30，40，50，60min)对人参皂苷Rbl酶水解生成人参皂苷Rd的组分变化情况进行HPLC分析结果图；
[0030]图6C为人参皂苷Rb2经TPEBGL1制备生成人参皂苷Rd的结果图；
[0031]图6D为不同反应时间下(0，5，10，30，50，70，80，90min)对人参皂苷Rb2酶水解生成人参皂苷Rd的组分变化情况进行HPLC分析结果图。
【具体实施方式】
[0032]下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅为本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0033]本发明提供了一种具有a-L-阿拉伯吡喃糖苷酶活力的葡萄糖苷酶，其氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示，命名为TPEBGLI ο
[0034]本发明也提供了编码本发明所述β -葡萄糖苷酶的DNA分子片段。由于密码子的简并性，可以存在很多种能够编码本发明所述的葡萄糖苷酶的核苷酸序列。
[0035]在一些实施方案中，本发明提供了可以编码所述的β -葡萄糖苷酶TPEBGL1的DNA分子，其核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示。
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