30°C培养7h ；以及不加诱导剂IPTG在37°C培养7h，用高速冷冻离心机分别将2mL培养液在4°C下，以13，OOOrpm离心15min，收集菌体。在菌体中加入一定体积缓冲溶液，重悬后，超声波破碎细胞，获得全细胞裂解液，去一定体积全细胞裂解液以13，OOOrpm离心15min，获得上清液可溶性蛋白溶液，沉淀即为不溶性蛋白一包涵体。我们通过测定上清液中葡萄糖苷酶活力来评价不同表达条件的效果，结果如图3所示。
[0085]图3 所示 1-6 分别表示:0，37°C不加 IPTG ;1，30°C不加 IPTG ;2，30。。加 IPTG 至终浓度0.0lmM ;30°C加IPTG至终浓度0.05mM ;30°C加IPTG至终浓度0.1mM ;30°C加IPTG至终浓度0.5mM。由图3可见，在30°C下诱导产酶时，IPTG添加浓度越大，酶产率越低，在30°C诱导下，不加IPTG时，重组酶含量较高，在提高培养温度至37°C时，重组酶与30°C培养条件下比较又有较大提高，可达到32U/mL。由此可见，本发明所述表达具有a-L-阿拉伯吡喃糖苷酶活力的葡萄糖苷酶的基因重组菌只需在最适生长条件(37°C )下培养无需诱导剂IPTG即可达到高效表达。
[0086]实施例4:本发明所述β -葡萄糖苷酶的定性测定
[0087]1、酶活的测定方法
[0088]反应体系100 μ L，5 μ L 20mmol/L对硝基苯β -D葡萄糖苷(pNPG)中加入85 μ LlOOmmol/L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH 6.0)，先在90°C孵育3min，再加入10 μ L酶液(稀释到合适的倍数)反应lOmin，显色后再加入lmol/L的碳酸钠溶液600 μ L终止反应。在405nm下测定吸光值。酶活力单位(U)定义为:在测定条件下，每分钟产生I ymol p-硝基苯酚所需要的酶量为I个酶活力单位。
[0089]2、最适反应pH的测定
[0090]在不同的pH (3.0-7，10mmoI/L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液.’7.5-9，10mmoI/L巴比妥-盐酸缓冲溶液)条件下，90°C分别测定酶活，结果如图4中a所示。
[0091]由图4中a结果可见，本发明所述葡萄糖苷酶的最适反应pH为6.0。
[0092]3、最适反应温度的测定
[0093]在60-100°C范围内，每隔5°C，分别测定酶活。缓冲为lOOmmol/L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液，pH 6.0，结果如图4中b所示。
[0094]由图4中b结果可见，本发明所述葡萄糖苷酶的最适反应温度为90°C。
[0095]4、pH稳定性的测定
[0096]将纯化的重组酶TPEBGL1在不同的pH(3.0_7，10mmoI/L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液；7.5-9，10mmoI/L巴比妥-盐酸缓冲溶液)下70°C处理lh，与不保温酶的酶相比，结果如图4中c所示。
[0097]由图4中c结果可见，本发明所述β -葡萄糖苷酶在ρΗ3.5-9.0条件下75°C保温Ih后仍能具有80%以上的残余酶活力。
[0098]5、温度稳定性的测定
[0099]在pH 6.0下，使酶在70°〇，80°〇，90°〇温度下分别保温不同的时间(0，10，30，60，90，120min)，再测定相对酶活，以未保温(4°C保存)的酶活性为100%，结果如图4中d所示:正方形表示90 °C ;菱形表示80 °C ;三角形表示70 °C。
[0100]由图4中d结果可见，本发明所述β -葡萄糖苷酶在70°C下保温2h残余酶活力高于 90%o
[0101]实施例5:本发明所述β -葡萄糖苷酶对葡萄糖耐受能力测定。
[0102]测定方法:在相同的反应体系(100 μ L，1mM pNPG, 50mM pH6.0柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液；)中加入葡萄糖至不同浓度，在最适反应条件下测定本发明所述葡萄糖苷酶活力，结果如图5所示。
[0103]由图5可知本专利所述β -葡萄糖苷酶TPEBGL1在葡萄糖终浓度400mM的反应体系中，有近50%的残余酶活力，其Ki系数为400mM，且该β -葡萄糖苷酶在反应体系中葡萄糖终浓度为0-200mM之间时，具有明显的激活作用，即在催化反应开始后酶活力逐渐提高，同时，在葡萄糖添加量50mM时达到最高，其酶活力为对照组(OmM葡萄糖)的1.4倍。
[0104]实施例6:本发明所述β -葡萄糖苷酶转化人参皂苷Rbl和Rb2制备Rd
[0105]人参皂苷Rbl标准品、人参皂苷Rb2、人参皂苷Re标准品和人参皂苷Rd标准品均购自成都曼斯特生物科技有限公司。
[0106]HPLC检测条件为:Agilent 1260Infinity ；DAD检测器检测波长为203nm，柱温为30°C，流动相流速为 1.2mL/min (A:水，B:乙腈;0min，A:B 为 70:30 ;1min，A:B 为 55:45 ;15min，A:B 为 40:60 ;18min，A:B 为 40:60 ；20min A:B 为 70:30 ；23min A:B 为 70:30)。
[0107]1.酶转化Rbl生成Rd。
[0108]酶转化反应体系为50 μ L，其中Rbl浓度为30g/L，酶添加量约为1.2U/mL，反应在pH 6.0，90°C下进行，分别对不同反应时间(0，5，10，15，20，25，30，50min)的样品利用HPLC进行成分检测，结果见图6A，6B。由图6B检测结果可见，在反应5min后即检出有人参皂苷Rbl转化为人参皂苷Rd，且随着反应时间的延长，转化率提高。在反应50min后，人参皂苷Rbl几乎完全转化为人参皂苷Rd，人参皂苷Rd得率约为97 %。
[0109]2.酶转化Rb2生成Rd。
[0110]酶转化反应体系为50 μ L，其中Rbl浓度为10g/L，酶添加量约为4U/mL，反应在pH
6.0，90°C下进行，分别对不同反应时间(0，5，10，30，50，70，80，90min)的样品利用HPLC进行成分检测，结果见图6C，6D。由图6D检测结果可见，在反应5min后即检出有人参皂苷Rb2转化为人参皂苷Rd，且随着反应时间的延长，转化率提高。在反应90min后，人参皂苷Rb2几乎完全转化为人参皂苷Rd，人参皂苷Rd得率约为99 %。
【主权项】
1.一种β -葡萄糖苷酶，其特征在于氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示。
2.编码权利要求1所述β-葡萄糖苷酶的核苷酸，其特征在于核苷酸序列如SEQ IDN0.2所示。
3.权利要求1所述β-葡萄糖苷酶的制备方法，其特征在于将SEQ ID N0.2所示的DNA片段插入表达载体获得重组质粒，将重组质粒转化宿主菌，以及其诱导表达条件和后续目的蛋白的纯化。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于步骤如下: 1)、以提取的?识petrophilaDSM 13995基因组DNA为模板，用具有SEQ IDN0:3所示的核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID N0:4所示的核苷酸序列的下游引物扩增，PCR扩增得到SEQ ID N0.2所示的DNA分子； 2)、将得到的DNA分子和pET-20b分别用NdeI和Xho I进行双酶切，连接得到含有β-葡萄糖苷酶的核苷酸序列的重组质粒； 3)、将步骤2)得到的重组质粒转化表达宿主菌JM109(DE3)，不加IPTG于37°C下诱导表达，离心收集菌体，破碎菌体后经Ni2+亲和层析柱纯化即得。
5.包含权利要求2所述的β-葡萄糖苷酶的核苷酸片段的重组质粒。
6.权利要求1所述β-葡萄糖苷酶在制备人参皂苷Rd中的应用。
7.一种通过权利要求1所述β -葡萄糖苷酶转化人参皂苷Rbl和Rb2制备人参皂苷Rd的方法，其特征在于所述β -葡萄糖苷酶在pH 4-8，温度30°C -95°C，酶解人参皂苷Rbl和Rb2制备得到人参皂苷Rd。
8.根据权利要求7所述β-葡萄糖苷酶转化人参皂苷Rbl和Rb2制备人参皂苷Rd的方法，其特征在于pH为6.0，温度为90°C。
【专利摘要】一种β-葡萄糖苷酶及其制备方法与应用，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明所述β-葡萄糖苷酶热稳定性优异，能耐受高温；本发明所述β-葡萄糖苷酶具有较高β-1,6-糖苷键水解能力同时具有较强的α-1，6-阿拉伯吡喃糖苷键水解能力，对人参皂苷Rb1和Rb2的转化能力强，本发明所述β-葡萄糖苷酶与人参皂苷Rb1和Rb2孵育一定时间后，检测到人参皂苷Rb1或Rb2几乎完全转化为人参皂苷Rd；本发明所述TPEBGL1的制备方法不需要诱导剂IPTG即可高效表达。
【IPC分类】C12N9-42, C12N15-56, C12N15-63, C12P33-20
【公开号】CN104611313
【申请号】CN201510026295
【发明人】赵林果, 解静聪, 赵东霞, 萧伟, 丁岗, 王振中
【申请人】南京林业大学
【公开日】2015年5月13日
【申请日】2015年1月19日