一类兼具抗菌和抗流感病毒活性的融合肽衍生物的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一类兼具抗菌和抗流感病毒活性的融合肽衍生物。
【背景技术】
[0002] 流行性感冒病毒是一种造成人、狗、马、猪及禽类等患流行性感冒的RNA病毒。在 分类学上，流感病毒属于正黏液病毒科，它会造成急性上呼吸道感染，并借由空气迅速的传 播，在世界各地常会有周期性的大流行。2003年12月中旬，由H5N1禽流感病毒（AIV)引 起的高致病性禽流感（highly pathogenic avian influenza, HPAI)袭击了亚洲，在不到2 个月的时间内，席卷了韩国、日本、中国和印度尼西亚等8个东亚和东南亚国家，导致死亡 或淘汰的禽只总数近1亿只。在世界卫生组织报导的348例确诊人类感染的病例中，有216 例死亡，占60%。2010年，甲型H1N1流感病毒大流行，全球有超过18337人被该病毒夺走 生命。
[0003] 除此之外，美国⑶C的统计数据显示，在流感流行季节中，约50%的死亡病例死于 肺炎，其中绝大部分是肺炎链球菌造成的。由此可知，不仅流感病毒本身带来严重危害，而 且流感病毒的感染导致人体的免疫力降低因而使得细菌定植的机率增加，造成细菌并发感 染，加重疾病。
[0004] 流感病毒结构自外而内可分为包膜、基质蛋白以及核心三部分。基质蛋白与病毒 最外层的包膜紧密结合起到保护病毒核心和维系病毒空间结构的作用。基质蛋白构成病 毒的外壳骨架，有基质蛋白（Ml)和膜蛋白（M2)。包膜表面具有血凝素（HA)和神经氨酸酶 (NA)。
[0005] 甲型流感病毒命名中的H代表流感病毒的融合蛋白--血凝素（hemagglutinin， HA)，HA是流感病毒的主要抗原，共有16个亚型，可以引起宿主强烈的免疫反应，为逃避宿 主的免疫系统监视，HA不断突变。
[0006] 目前，治疗流感病毒的药物有两类，作用于M2离子通道和神经氨酸酶2个靶点。 (1)作用靶点为流感病毒表面的M2离子通道蛋白的代表药物有金刚烷胺和金刚烷乙胺，此 类药物在80年代获得美国FDA批准用于治疗甲型禽流感。（2)神经氨酸酶抑制剂不仅对甲 型流感病毒有抑制作用，还可以抗乙型禽流感病毒。此类药物不易引起耐受性且耐受性好， 目前已上市的药物扎那米韦（zanamivir)和奥塞米韦（oseltamivir)，对9种亚型的NA都 有抑制作用，不易引起耐药性。
[0007] HA蛋白由HA1和HA2两个亚基组成。在流感病毒感染宿主细胞的时候，血凝素前 体HA0水解成HA1和HA2亚基，这是是禽流感病毒具有感染性的必要步骤。其中HA1识别 并结合宿主细胞膜表面的唾液酸受体，HA2能够协助病毒包膜与细胞膜的融合。因此任何 分子若能够阻止HA0的水解具有抗病毒感染的活性。
[0008] 目前阻断血凝素前体HA0水解的融合抑制剂研究成果有：一些丝氨酸蛋白酶抑制 齐II，如抗蛋白酶肽，亮肽酶素，e-aminocaproic酸，萘莫司他，肺部表面活性剂（一种具有表 面活性的脂蛋白复合物，磷脂蛋白，由小泡2型细胞产生），人黏液蛋白酶抑制剂都能够在 细胞模型和动物模型上通过抑制HAO的水解达到抗流感病毒的感染。抗碱性氨基酸蛋白酶 的拟肽抑制剂（dec-R-V-K-R-cmk)有抗H7高致病性禽流感病毒的活性，能够抑制病毒复 制。后来研究发现拟肽抑制剂（dec-R-V-K-R-cmk)还可以抑制广泛存在的2型跨膜丝氨酸 蛋白酶MPSL/TMPRSS13和其他胰岛素蛋白酶如胞浆素。Kilo等人报道了 MPSL/TMPRSS13能 够水解H5亚型和H7亚型。因此，人体中MPSL/TMPRSS13的天然抑制剂能够作为先导化合 物来开发以血凝素为靶点的抗病毒药物。
[0009] 目前多肽化合物抑制流感病毒有以下三个方面的研究（1)设计唾液酸类似物多 肽竞争性与HA1结合Teruhiko et al等报道他们从一个随机肽库中筛选针对出H1和H3 病毒株的小分子多肽。筛选出来的多肽对HA有亲和性。随后他们又设置子肽库并随机进 行第二和第三次筛选以找出能具有更好的与HA作用的多肽。对于最后找出来的多肽，他们 利用分子对接模拟实验显示它们具有与唾液酸类似的结构，可以竞争性与HA1的受体结合 口袋结合。其中C 17H35C〇-ARLPRTMV-NH#P C 17比5(：0-41?1^1?-順2表现出阻止禽流感病毒H1N1 进入宿主的高活性，其IC50分别是3. 0和1. 9 y M。
[0010] 在2006年，Jeremy C. Jones等从纤维母细胞生长因子中发现一个20个氨基酸 的多肽EB(NH2-RRKKAAVALLPAVLLALLAP-C00H)能特异性地与HA1结合，阻止HA与细胞表 面的受体结合，在体内和体外都表现出广谱的抗流感病毒活性。不久，一个更短的多肽 Pl(CNDFRSKTC)具有与EB同样的抑制机制被开发出来。（2)屏蔽宿主细胞膜上的唾液酸受 体是另一种策略Teruhiko Matsubara等报道，他们从一个噬菌体随机肽库中确定一个具 有对细胞表面唾液酸亲和力的几个多肽，并通过丙氨基酸扫描发现这几个多肽中的7个氨 基酸残基对多肽与唾液酸的识别起到关键性作用。这些肽与细胞表面的唾液酸结合可以 明显抑制禽流感病毒在体内的复制扩散。他们通过对来自N端固醇化的两个多肽化合物 C18-c01 (GWWYKGRARPVSAVA)和 C18-c03(RAVWRHSVATPSHSV)的多肽部分 c01 和 c03 分别进 行烷基化，发现可以提高它们与唾液酸受体的结合能力，它们的IC50分别为3. 2和6. 5 y M。 (3)以HA2为靶点的多肽由于流感病毒与HIV病毒同属于I类膜蛋白，有相同的进入机制， 现在已经有许多科学家正尝试开发类似恩夫韦肽的抗禽流感病毒的多肽。但是，要复制恩 夫韦肽不是一件容易的事情。相比较HIVgp41在胞外的中性条件下介导的膜融合，HA介导 的膜融合是细胞内的酸性条件下。因而，为了阻止融合过程，来自HA2的HR2区域的活性肽 必须事先透过细胞膜进入胞内，并在酸性条件下保持稳定的结构。但到目前为止，仅有一组 科学家报道说来自HA2并连接胆固醇的多肽能阻止禽流感病毒和细胞膜融合和病毒感染。 他们假设由于胆固醇的作用，多肽能穿过细胞膜，在细胞胞吞的过程中进入胞内从而阻止 禽流感病毒和细胞的膜融合。
[0011] 此外抗流感病毒药物研究还有：靶向血凝素的DNA疫苗、靶向血凝素的病毒载体 疫苗、靶向血凝素的类病毒粒子疫苗、靶向血凝素的重组亚单位疫苗和靶向血凝素保守序 列的疫苗。
[0012] 在抗菌方面，抗菌肽（AMPS)是宿主免疫系统抵抗病原微生物入侵的保守组成部 分。它们代表着一组新的抗菌药物家族，在细菌、真菌、植物和动物等生物体中广泛存在。如 今，由于细菌耐药株的产生，人类迫切需要研发新的、具有更好效能的抗生素来替代老的药 效已经降低或者失效的抗生素。在这点上，因为具有快速杀菌速率和不易产生耐药性的优 点，抗菌肽被认为是取代传统抗生素的新一代候选化合物。抗菌肽的来源很广泛，除了天然 的防御肽，还有合理设计的合成肽。与天然的宿主防御肽相比，合成肽更易获得、免疫原性 较低并且成本更低。
[0013] 抗菌肽的出现为人们寻找理想的抗菌药物提供新的领域，因此抗菌肽具有巨大的 应用潜力。自从Boman等人在1972年首先在果蝇中发现了抗菌肽，随后1981年Steiner 等人又从美国天蚕中成功地分离到两种抗菌肽Cecropin-A和Cecropin-B后，截止2014 年初，已发现的天然AMPs超过2000条。近年来，计算机辅助药物分子设计技术的发展，极 大的促进了抗菌肽的研究和开发，已有超过十个根据天然阳离子抗菌肽合成的类似物进 入临床或临床前的试验阶段，典型的代表是蛙皮提取的Magainins是第一种进入药品开 发程序的抗菌肽，美国马盖宁制药公司已经开发筛选出对细菌、病毒和肿瘤细胞均有明显 的杀伤作用的两种新型抗菌肽：Pexiganan(MSI-78)和MAI1278现已进入临床III期试验， 可以预测在不久的将来抗菌肽将会成为寻找新药的重要领域。TriPep公司正在研制的小 肽GPG，已经在欧洲进行I/II期临床试验，治疗两周以上发现，病毒复制减慢，显示出一 定的抗HIV应用前景；口服抗菌肽Ambicin和Isegangn已成功地完成I期安全性评价； 加拿大MicroLogix生化技术公司的两种抗菌肽MBI-226和MBI-594进入II期或III期的 严重粉刺感染的临床研究，其中MBI-226III期临床试验结果表明，在诱导期只有极小的刺 激反应，与阴性组对照，蓄积刺激反应更小。最引人注目的Trimeris公司的抗HIV抗菌肽 Enfuvritide(T20)已在数年前成功上市。
[0014] 两类治疗流感病毒的药物存在不足：其中金刚烷胺、金刚烷乙胺等药物只能抑制 甲型禽流感，对乙型禽流感无效，用药产生副作用大，而且其只作用于离子通道M2靶点，容 易产生耐药性。同时，目前在临床上已经观察到奥塞米韦的耐药株。2009年大流行的猪流 感病毒（H1NI)就对奥塞米韦耐药，而且这种耐药突变获得稳定遗传。扎那米韦对奥赛米韦 的耐药株仍然有效。科学家在用奥塞米韦治疗高致病性禽流感H5NI患者，虽然能降低患者 病毒载量，但最终不能有效降低致死率。
[0015] 一些抑制HA0水解的抗蛋白酶，氨基酸序列长，成本高，机体用药容易产生抗原免 疫反应。本研究的多肽最长只有22个氨基酸，相对来说，成本低，不容易产生免疫反应。 [0016]目前以HA2作为靶点抑制流感病毒进入宿主的研究少，仅有一组科学家报道说来 自HA2并连接胆固醇的多肽能阻止禽流感病毒和细胞膜融合和病毒感染。他们假