型的融合肽序列为:GLFGAIAGFIENGWEGMI2GWYG,截取得到氨基酸序列 I£NGW£GMI2GWYG和I£NGW£GMI2GWY,将新序列的2号位谷氨酸(Glu)、6号位谷氨酸(Glu) 和10号位的天冬氨酸(Asp)用上述"一"中所述的氨基酸或者类似性质的氨基酸、与氨基 酸结构类似或者与氨基酸化学性质类似的化合物替代得到融合肽衍生物:
[0115] I_NGW_GMI_GWYG ; I_NGW_GMI_GWY ;
[0116] 横线位置用上述"一"中所述的氨基酸或者类似性质的氨基酸、与氨基酸结构类似 或者与氨基酸化学性质类似的化合物任意组合替代。
[0117](2)、基于H5亚型的融合肽得到融合肽衍生物
[0118]H5亚型的融合肽序列为:GLFGAIAGFimGWQGMV2GWYG,截取得到氨基酸序列 I巡GWQGMV2GWYG和I巡GWQGMV2GWY,将新序列2号位谷氨酸(Glu)、3号位甘氨酸(Gly)、6 号位谷氨酰胺(Gin)和10号位的天冬氨酸(Asp)或者2号位谷氨酸(Glu)、10号位的天冬 氨酸(Asp)用上述氨基酸或者类似性质的氨基酸、与氨基酸结构类似或者与氨基酸化学性 质类似的化合物替代得到融合肽衍生物:
[0119] I_GW_GMV_GWYG ;I_GGff Q GMV_GWYG ; I_GW_GMV_GWY ;
[0120] I_GGff Q GMV_GWY ;
[0121] 横线位置用上述"一"中所述的氨基酸或者类似性质的氨基酸、与氨基酸结构类似 或者与氨基酸化学性质类似的化合物任意组合替代。
[0122] (3)、基于H9亚型的融合得到融合肽衍生物
[0123] H9亚型的融合肽序列为:GLFGAIAGFimGWPGLVAGWYG,截取得到氨基酸序列 IE^GWPGLVAGWYG和IE^GWPGLVAGWY,将新序列的2号位谷氨酸(Glu)、10号位的丙氨酸 (Ala)或者2号位谷氨酸、3号位甘氨酸(Gly)和10号位的丙氨酸用上述氨基酸或者类似 性质的氨基酸、与氨基酸结构类似或者与氨基酸化学性质类似的化合物替代得到融合肽衍 生物:
[0124] I_G GWP GLV_GWYG ;I_GWP GLV_GWYG ;
[0125] I_G GWP GLV_GWY ;I_GWP GLV_GWY ;
[0126] 横线位置用上述"一"中所述的氨基酸或者类似性质的氨基酸、与氨基酸结构类似 或者与氨基酸化学性质类似的化合物任意组合替代。
[0127] 五、基于截取融合肽的C端13和14位氨基酸序列的进一步改造得到融合肽衍生 物
[0128] 基于截取融合肽的C端13和14位氨基酸序列的进一步改造获得的融合肽衍生物 为:
[0129] I_N Gff_GMI_GWYG ;I_N Gff_G MI_GWY ; I_GW_GMV_GWYG ;
[0130] I_GGff Q GMV_GWYG ; I_GW_GMV_GWY ;I_GGff QGMV_GWY ;
[0131] I_GGWPGLV_GWYG ;I_GWP GLV_GWYG ;I_GGWP GLV_GWY ;
[0132] I_GWP GLV_GWY ;
[0133] 横线位置依然用上述"一"中所述的氨基酸或者类似性质的氨基酸、与氨基酸结 构类似或者与氨基酸化学性质类似的化合物任意组合替代;同时,斜体加阴影表示的甘氨 酸G还可以独立替换成丙氨酸(Ala)、D-丙氨酸(D-Ala)、丙氨酸(P-Ala)、N-甲基 丙氨酸(N-Me-Ala)等化学结构、化学性质相似的氨基酸或者氨基酸类似物替代,或者用 亮氨酸(Leu)、D-亮氨酸、高亮氨酸(HomoLeu)、D-高亮氨酸(D-HomoLeu)、N-甲基亮氨酸 (N-Me-Leu)、正亮氨酸(Nle)、D_正亮氨酸(D-Nle)、N_甲基正亮氨酸(N-Me-Nle)等化学结 构、化学性质相似的氨基酸或者氨基酸类似物替代。
[0134] 六、基于截取融合肽的N端13位氨基酸序列设计的融合肽衍生物
[0135](1)、基于H3亚型的融合肽得到融合肽衍生物
[0136] 截取H3亚型的融合肽序列:GLFGAIAGFI£NGW£GMI2GWYG氮端13位氨基酸得到氨 基酸序列为GLFGAIAGFIENG,将11号位谷氨酸(Glu)用上述氨基酸或者类似性质的氨基酸、 与氨基酸结构类似或者与氨基酸化学性质类似的化合物替代得到融合肽衍生物:
[0137]GLFGAIAGFI_NG
[0138] 横线位置用上述氨基酸或者类似性质的氨基酸、与氨基酸结构类似或者与氨基酸 化学性质类似的化合物任意组合替代。
[0139] (2)、基于H5亚型的融合肽得到融合肽衍生物
[0140] H5亚型的融合肽序列:GLFGAIAGFIMGWQGMVSGWYG氮端13位氨基酸得到氨基酸序 列为GLFGAIAGFIESG,将11号位谷氨酸(Glu)和12号位甘氨酸(Gly)用上述氨基酸或者类 似性质的氨基酸、与氨基酸结构类似或者与氨基酸化学性质类似的化合物替代得到融合肽 衍生物:
[0141] GLFGAIAGFI-G ;GLFGAIAGFI_GG ;
[0142] 横线位置用上述氨基酸或者类似性质的氨基酸、与氨基酸结构类似或者与氨基酸 化学性质类似的化合物任意组合替代。
[0143] 七、对上述所有融合肽衍生物序列的修饰
[0144] 除了以上所有融合肽衍生物氨基酸序列以外,还可以对其氮端、碳端、或/和任一 氨基酸残基进行修饰改造得到仍具有抗菌抗流感病毒的新融合肽衍生物。例如,融合肽衍 生物的脂化(例如,脂肪酸化)、糖基化、酰胺化、羧酸化、磷酸化、酯化、N-酰化、通过二硫键 环化、转化成酸加成盐、二聚体化或多聚体化、缀合化。举例来说,本发明所述融合肽衍生物 可以是脂化衍生物。所含的脂质分子可以包括本领域己知的任何脂质,例如,脂肪酸,磷脂 基团,糖磷脂酰肌醇,磷脂酰丝氨酸,磷脂酰乙醇胺,鞘磷脂,磷脂酰胆碱,心磷脂,磷脂酰肌 醇,磷脂酸,溶血磷酸甘油酯和胆固醇基团。优选地,所述脂化衍生物是脂肪酸衍生物,所述 脂肪酸分子可以是任何C6-C20脂肪酸,例如,月桂酸、棕榈酸、肉豆蘧酸、硬脂酸、油酸、亚 油酸、亚麻酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸、芥酸或花生酸等。所述脂肪酸还可以在任意碳原 子上任选地包含其他官能团,例如,一个或多个氨基,一个或多个羧基。所述脂肪酸分子可 以附着在本发明融合肽衍生物任何适当的部分。例如,在本发明的多肽氨基端、羧基端、或 氨基和羧基两端包括脂肪酸分子。脂肪酸分子可以直接或通过连接体附着到本发明的融合 肽衍生物。此外还包括胆留醇等环戊烷多氢菲和五环三萜类分子的氨基端衍生化。
[0145] 实施例2
[0146] 本实施例中所涉及的相关实验方法如下:
[0147] 1.菌株、细胞和培养条件
[0148] 本研究使用的菌株:Staphylococcus aureus(ATCC12600),Escherichia coli(ATCC25922),Pseudomonas aeruginosa(ATCC25853)和 Streptococcus mutans(ATCC25175)。所有菌种保存在-80 °C 冰箱(Microbank vials)。培养条件: S.aureus、S.mutans 用 TH 培养基(Todd-Hewitt broth)在 37 °C 下培养,E.coli、 P. aeruginosa 用 LB 培养基(Luria-Bertani broth)在 37°C下培养。除了 S.mutans 在厌 氧条件下培养,其余三个菌在需氧条件下培养。
[0149] MDCK细胞、293T细胞来源于ATCC,用DMEM培养基(含谷氨酰胺、10% FBS)在 37°C、5% C02条件下培养。
[0150] 2?多肽合成
[0151] 肽都是通过酰胺MHBA树脂使用标准9-芴甲基羰基Fmoc固相合成方法合成。序 列的合成是在ABI 433A多肽合成仪中进行。肽伸长反应条件为:以标准HBTU/HOBt为耦合 试剂,以二甲基甲酰胺(DMF)为溶剂,2倍过量的二异丙基乙胺(DIEA),8倍过量的含Fmoc 保护基团的氨基酸或10倍过量的游离脂肪酸。脂肪酸是耦合使用标准用于所有合成氨基 酸耦合条件。肽都是使用试剂M从树脂裂解,试剂M包括87. 5%三氟乙酸,2. 5%乙二硫 醇,5%茴香硫醚和5%去离子水(3h,室温),粗产品沉淀在甲基叔丁基醚,相同的溶剂洗 两次。肽荧光标记进行氨基酸相同的耦合过程采用罗丹明作为酸溶剂,反应12个小时。每 个肽的分子量通过电喷雾电离质谱(ESI-MS,Waters)证实。结果如表1中详细说明。肽纯 化使用RP-HPLC,实验条件:流速lmL/min ;流动相溶液A水(0. 1%三氟乙酸)溶液B乙腈 (0? 1%三氟乙酸);梯度从 15%到 20% B(2min),从 20%到 60% B(6min),从 60%到 80% B (4min),从 80 % 到 90 % B (4min)。
[0152] 3.最低抑菌浓度测试
[0153] 细菌37°C过夜培养得lX108CFU/mL,培养基稀释到lX105CFU/mL。肽浓度从 125iig/mL稀释到1.95iig/mL,再加入lOOiiL 1X105细菌中。在37°C培养17到20小时 后记录最低抑菌浓度。所有实验平行四到六个独立重复实验。
[0154] 4.时间杀菌测定法