siRNA及其在用于治疗和/或预防眼部病症的方法和组合物中的应用
【专利说明】siRNA及其在用于治疗和/或预防眼部病症的方法和组合 物中的应用 发明领域
[0001] 本发明涉及提供siRNA产物及其在利用RAN干扰用于治疗和/或预防与瞬时感受 器电位香草素（transient receptor potential vanilloid，TRPVl)的高水平表达和/或活 性相关的眼部病症的方法和组合物中的应用。其中，与眼睛疼痛相关的眼部病症，如屈光手 术后的角膜不适和改变的敏感性、使用隐形眼镜、干眼综合征和舍格伦综合征（Sjogren's syndrome)，将得到减轻。
[0002] 发明背景
[0003] RNA干扰（RNAi)是大部分真核细胞的天然存在的调节机制，其使用小的双 链RNA(dsRNA)分子来指导同源依赖性基因沉默。Fire和Mello在虫子秀丽隐杆线虫 (C. elegans)中发现RNA干扰{Fire，1998}于2006年被授予诺贝尔奖。在其第一次记载后 不久，RNAi也被表明在哺乳动物细胞中发生，不是通过长的dsRNAs而是提供过21个核苷 酸长的双链小干扰RNAs(siRNAs)发生{Elbashir，2001}。
[0004] 认为RNA干扰过程是用于防止外源基因表达的进化上保守的细胞防御机制，并且 通常由多个门和群所共有，其中其称为转录后基因沉默。
[0005] 由于RNAi机制的发现，研宄已经激增，以发现可以选择性改变基因表达的新化合 物作为治疗人类疾病的新方法，其通过针对使用包括小分子或蛋白的传统药物方法而是 "不能用药的"靶标而进行治疗。
[0006] 按照目前的常识，当长的双链RNAs被称为切酶（Dicer)的RNA酶III样蛋白加工 时，起始RNAi机制。蛋白切酶典型地包含N端RNA解旋酶结构域、结合RNA的所谓的Piwi/ Argonaute/Zwille(PAZ)结构域、两个RNA酶III结构域和双链RNA结合结构域（dsRBD) {Collins，2005}，并且其活性引起将长的双链RNAs加工成具有2个碱基的3'突出端和5' 磷酸和3'羟基的21-24个核苷酸的双链siRNAs。然后，得到的siRNA双链体结合在称为 RNA诱导的沉默复合物（RISC)的效应子复合物中，其中，当通过RNA解旋酶活性腺苷-三 磷酸（ATP)-依赖性解旋双链siRNA分子{Nykanen，2001}时，该siRNA的反义或引导链引 导RISC是被并且分裂目标mRNA序列{Elbashir，2001}。导致mRNA降解的RISC的催化活 性由核酸内切酶Argonaute 2(AG02)调节{Liu，2004;Song，2004}。AG02属于高度保守的 Argonaute蛋白家族。Argonaute蛋白是含有两个共有结构域，即PIWI和PAZ结构域的~ lOOKDa的高碱性蛋白{Cerutti，2000}。PIWI结构域对于与切酶相互作用是极其重要的，并 且含有负责mRNAs分解的核酸酶活性{Song，2004}。AG02利用siRNA双链体的一条链作为 向导以发现含有互补序列的信使RNAs，并且分解相对于引导链5'末端的碱基10与11之 间的磷酸二酯骨架{Elbashir，2001}。RISC活化过程中的重要步骤是通过AG02分解有义 链或过客链，从复合物中去除该链{Rand，2005}。分析siRNA引导链与PIWI结构域之间的 相互作用的结晶学研宄揭示仅核苷酸2-8组成引导RISC识别靶标mRNA的"种子序列"，并 且在该序列中单个核苷酸的错配可能彻底影响该分子的沉默能力{Ma，2005 ;Doench2004 ; Lewis，2003}。一旦mRNA已被分解，并且由于在片段中存在未保护的RNA末端，则所述mRNA 被细胞内的核酸酶进一步分解和降解，并且将不再翻译成蛋白{Orban，2005}，而RISC将重 新循环至后续的轮数中{Hutvagner，2002}。这组成导致特定的mRNA分子和相应的蛋白的 选择性减少的催化过程。可以以通过直接向细胞或组织中递送siRNA效应子而调节任意选 择的基因的目的来研宄这种天然的基因沉默机制，其中其将激活RISC并且产生所靶向的 mRNA的有效的且特异性的沉默。
[0007] 已经公开了许多描述为获得最大的效力siRNA所应该具有的理想的特征、关于长 度、结构、化学组成和序列的研宄。Tuschl与合作者在W002/44321中描述了用于siRNA设 计的初始参数，但是自此之后已经公开了多种后续的研宄、算法和/或改进。此外，已经投 入了相当多的努力来增强siRNA的稳定性，原因在于，考虑到RNA酶在生物流体中的普遍存 在的性质，这被认为是基于siRNA的治疗的主要障碍之一。用于稳定性增强所遵循的主要 策略之一是使用修改的核苷酸，如2' -0-甲基核苷酸，2' -氨基核苷酸，含有2' -0或4' -C 亚甲基键的核苷酸。此外，已经描述了对连接相邻的核苷酸的核糖核苷酸骨架的修饰，即， 通过引入硫代磷酸酯修饰的核苷酸进行。似乎增强的稳定性通常与功效成反比（Parish， 2000)，并且仅有特定数量的、位置和/或修饰的核苷酸的组合才能导致稳定的沉默化合 物。由于这是基于siRNA的治疗的主要障碍，已经公开了不同的研宄，其描述了表现出良好 的结果的特定的修饰模式，这些的实例包括EP1527176, W02008/050329, W02008/104978或 W02009/044392,尽管在参考文献中可以找到更多。
[0008] 瞬时感受器电位香草素-l(TRPVl)，还称为香草素感受器l(VR-l)，是一种辣 椒素-响应性配体门控阳离子通道（capsaicin-responsive ligand-gated cation channel)，其在1997年首先被发现（Caterina，1997)。TRPV1主要表达在二级神经元上， 并且作为热、辣椒素、质子和内香草素（endovanilloids)的分子检测剂（Caterina，2001 ; Montell，2002 ;Baumann，2000)。但是本申请的发明人还已经发现了 TRPV1在来自泪腺和睫 状体的组织中的表达。
[0009] 当TRPV1被激动剂（如辣椒素）和其他因子（如热、酸中毒、脂氧合酶产物或花生 四烯酸乙醇酰胺）激活时，钙进入细胞，并且起始疼痛信号。通道的活化诱导神经肽从中枢 和外周感觉神经末梢的释放，导致疼痛感知、神经源性的炎症以及有时导致平滑肌收缩和 咳嗽。事实上，最近的证据提示TRPV1在疼痛、咳嗽、哮喘和尿失禁中的作用（Jia，2005)。 事实上， TRPV1是已知的响应疼痛刺激进行止痛治疗的靶标。并且，设计使用不同的技术减 少TRPV1的表达的治疗已经记述在W02004/042046中，或记述在（Schubert，2005)中，其专 注于疼痛治疗。
[0010] 多形性伤害感受器是在角膜中存在的最丰富的伤害感受器类型。存在药理学证据 表明这些感受器纤维表达TRPV1受体，原因在于它们响应辣椒素、热和酸。并且，高剂量的 辣椒素使得角膜多形性伤害感受器对热和酸的应答失活，而机械应答性保持不受影响。这 表明存在于角膜多形性神经末梢的TRPV1受体被选择性失活。因此，可能的是针对伴随着 该组织中的炎症和刺激性过程的角膜损伤和持续的疼痛感受的急性伤害性应答的重要部 分是由TRPV1活化调节的。
[0011] 此外，W02007/045930记述了 TRPV1特异性siRNAs用于治疗与眼疼和干眼综合征 相关的眼科病理学的应用。然而，本发明提供了用于减少TRPV1表达并且因此减轻眼部不 适的改善的产品。相对于传统化学抑制剂，使用siRNA产品治疗这些病症的优点在于基于 siRNA的治疗将具有持续更久的效果。该结果是由于这样的事实导致的：一旦不再存在效 应分子，则细胞将必须从最开始合成新的感受器；而传统的治疗将使得细胞膜上的感受器 水平不受影响。
[0012] 由于目前的生活模式，受与改变的眼部敏感性相关的眼科病理学的影响的人数非 常高，并且预测随着人口的老龄化而增加。屈光手术和隐形眼镜的使用通常引起改变的角 膜敏感性和患者的干眼感受。这被长久注视电脑屏幕的工作时间和使用通常进一步使空气 变干燥的空调系统而进一步加剧。此外，眼泪的数量和质量随着年龄下降。伴有干眼综合 征的症状包括眼部组织的痒、烧灼感和刺激性。更严重的干眼症形式发生在患有舍格伦综 合征的患者中。存在这些感受中的一种或不同的组合称为本文意义中的眼部疼痛。目前， 估计干眼综合征影响多于一千万的美国人。
[0013] 附图描沐
[0014] 图1是在用靶向TRPV1的不同siRNAs转染HeLas细胞后，利用Qrt-PCR显示TRPV1 的暂时的表达模式的图表，所述靶向TRPV1的不同siRNAs为：本发明所述的化合物（SEQ ID NO:2)，之前记载的靶向不同区域的化合物（SEQ ID NO:7)和另外四种设计靶向TRPV1的 siRNAs (SEQ ID NO :17-20)以及用作阴性对照的混杂序列。显示相同结果的两种备选的表 现方式A和B以确保清楚性。
[0015] 图2是显示在用本发曰月的不同siRNAs转染HeLas细胞后，利用Qrt-PCR显示TRPV1 的暂时的表达模式的图表，所述本发明的不同siRNAs为：SEQ ID NO :2至SEQ ID NO :6,以 及SEQ ID NO :8至SEQ ID NO: 16,和用作阴性对照的混杂序列。
[0016] 图3显示在用辣椒素(capsaicin)刺激后，与辣椒平（capsazepine，一种接受的用 于TRPV1依赖性疼痛的止痛剂）相比，用本发明的化合物（SEQ IDN0:2)治疗的兔的眼睛 的测量的眼睑开孔（_)的时间表。
[0017] Mi是显示在用辣椒素诱导疼痛后由用本发明的化合物（SEQIDNO :2)和辣椒平 治疗所导致的眼睑开孔关于检测之前的值的比率（％)的图。
[0018] 图5是显ZK在暴露于10%血衆中24小时后残留的完好的广物的量（％ )的图。
[0019] 图6是显示眼组织中基于5-磷酸化的完好的反义链的SEQ ID NO :2浓度的图，其 意指在细胞质区室中存在并且通过5' -磷酸化活化的SEQ ID NO :2 (母体化合物）的完好 的非代谢的反义链的量。左侧柱状物：5min ;右侧柱状物：30min。
[0020] 发明详沐
[0021] 在第一方面，本发明涉