一种在微流控芯片中同时利用抗原抗体特异性识别和细胞尺寸差别分选肿瘤细胞的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种分选肿瘤细胞的方法，具体涉及一种在微流控芯片中同时利用抗原抗体特异性识别和细胞尺寸差别分选肿瘤细胞的方法。
【背景技术】
[0002]循环肿瘤细胞(Circulating tumor cells，CTCs)通常是指来自于原发肿瘤组织，经脱落进入人体血液循环系统的肿瘤细胞。相当多的事实表明CTCs在转移过程中能够在不同的组织上寄居并可以在许多转移后的固相肿瘤上发现。鉴于实体肿瘤患者因癌症导致死亡的原因多数是因肿瘤转移这个事实，早期的循环肿瘤细胞诊断在人体肿瘤活组织检查和判断疾病进展中起着关键作用。人体外周血中检测到的肿瘤细胞数量，对疾病分期、治疗评估以及药物监控等方面起着重要作用。同时，对检测到的CTCs进行基因分子方面的研宄对于我们理解肿瘤转移与复发也具有重要意义。然而，CTCs是很稀少的，转移癌患者体内的每19个血液细胞中只有几个CTC，因此对于它们的分选是一个极大的技术挑战。
[0003]近年来，CTCs灵敏的、特异的检测技术已经建立，它们使用不同的工作机制，例如，免疫磁性分离技术、增加细胞跟基底频繁接触而进行分选的微流控技术和基于不同细胞尺寸来分选CTCs的微型过滤器设备。目前，CTCs的分选机理最常用的是利用特异性抗体对其表面表达的肿瘤标记物，如上皮细胞粘附因子(epithelial cell adhes1n molecule,EpCAM)，进行特异性的抗原抗体吸附来进行分选。其次是利用CTCs与其他细胞的物理特性差异进行非特异性的分选，如细胞尺寸、密度和形变等的差异性。其中基于尺寸大小的微流控细胞分选技术是当前CTCs研宄领域的一个热点。微流控芯片分析技术以其快速、高效、高通量、低消耗、集成化和微型化等优势，将会更温和、快速地操控和分选活细胞，有利于更准确高效地提取血液等体液样品中的信息，非常适用于血细胞、肿瘤细胞等体细胞的分选。
[0004]基于尺寸大小的肿瘤细胞分选是一种快速简便的细胞筛选技术，其分选原理是基于肿瘤细胞尺寸通常比外周血细胞(如白细胞、红细胞和血小板等)略大这一事实。其中肿瘤细胞粒径范围一般在10-30 μ m，血细胞尺寸在6-16 μ m，由于它们之间存在着一个重叠的范围，并且由于肿瘤细胞的异质性，不同的肿瘤细胞在尺寸及形变能力上都会有极大的不同，从而直接影响了单纯基于细胞尺寸分选的技术在肿瘤细胞筛选上的纯度。因此本发明在微流控技术和抗原抗体特异性识别的基础上引入了一种新的更有效的同时利用细胞尺寸大小的分选技术，通过选择性的扩大肿瘤细胞的分选尺寸，从而扩大其与血细胞尺寸差异性，提高了肿瘤细胞的筛选纯度。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于克服现有技术存在的缺点与不足，提供一种新的在微流控芯片中同时利用抗原抗体特异性识别和细胞尺寸差别分选肿瘤细胞的方法。该方法通过抗原抗体特异性识别选择性的扩大了肿瘤细胞的分选尺寸，对肿瘤细胞的区分、筛选效率及纯度更高，并且分选出来的肿瘤细胞能够被释放及培养。
[0006]为了达到以上目的，本发明采用以下技术方案:
[0007]一种在微流控芯片中同时利用抗原抗体特异性识别和细胞尺寸差别分选肿瘤细胞的方法，包括如下步骤:
[0008](I)制备可进行尺寸分选的微流控芯片:该芯片主要包含一个宽度为300-800 μ m的主通道，连接在主通道一侧的3-6条宽度为200-500 μ m的宽支路以及另一侧的10-25条宽度为20-30 μ m的窄支路。
[0009](2)在35-100 μ m的二氧化硅微球表面包裹一层的明胶，得到具有明胶表面的二氧化硅微球(S12OGel)。
[0010](3)在S12OGel的明胶表面修饰上具有特异性免疫识别肿瘤细胞功能的抗体，得到抗体修饰的S12OGel。
[0011](4)将含有肿瘤细胞的样品与抗体修饰的S12OGel混匀孵育(使S12OGel的抗体与肿瘤细胞表面抗原特异性结合以捕获住肿瘤细胞)得混合样品，再通入微流控芯片的主通道，同时从宽支路注入PBS，分别在主通道的另一侧及窄支路收集捕获住肿瘤细胞的微球与未被微球捕获的细胞。
[0012](5)将收集的捕获住肿瘤细胞的微球用明胶酶进行降解释放肿瘤细胞。
[0013]步骤(I)中所述的微流控芯片优选为:高度100 μ m，主通道宽度550 μ m，4条宽度为400 μ m的宽支路，16条宽度为30 μ m的窄支路。
[0014]步骤(2)中所述的二氧化硅微球的粒径优选为50 μ m。
[0015]步骤⑵中所述的S12OGel表面的明胶的厚度优选为10_50nm。
[0016]步骤⑵优选包括如下步骤:1)将二氧化硅微球加入到无水乙醇中，加热升温至50-80°C后滴入3-氨基丙基三乙氧基娃烧(3-Aminopropyltriethoxysilane, APS)磁力搅拌2 - 4 h，然后经过无水乙醇、去离子水离心洗涤后得到了氨基修饰的二氧化硅微球(NH2-S12)。2)将NH2-S1^新分散到去离子水中，加入戊二醛，搅拌5-20h，然后经过去离子水离心洗涤后得到了醛基修饰的二氧化硅微球(CHO-S12)。3)将CHO-S12再次分散到去离子水中，加入明胶，搅拌3-5h后用去离子水离心洗涤得到表面均匀包裹上一层明胶的二氧化硅微球(S12OGel)。
[0017]步骤(3)中所述的抗体优选为ant1-EpCAM。
[0018]步骤(3)优选包括如下步骤:1)将S12OGel浸泡在无水乙醇中进行消毒灭菌，再将 S12OGel 浸入(3-疏基丙基)三甲氧基娃烧(3-mercaptopropyl-trimethoxysilane, MTPMS)溶液中反应45-120分钟，再用无水乙醇洗涤。2)将I)处理的微球浸入到4-马来酰亚胺基丁酸-N-琥珀酰亚胺酯(GMBS)溶液中反应45-60分钟，分别用无水乙醇、DMSO洗涤。3)将2)处理的微球浸入链霉亲和素(SA)溶液中，4°C过夜处理，用PBS洗涤。4)对3)处理的微球进行ant1-EpCAM修饰l_3h，用PBS洗涤得到抗体修饰的S12OGel。
[0019]步骤(4)中所述的混合孵育的条件优选为通过细胞混匀仪室温下搅拌30min，转速设定为lOrpm。
[0020]步骤⑷混合样品中抗体修饰的S12OGel的数量优选为1.6X 105/mL。
[0021]步骤(4)中主通道进样口混合样品的流速优选为70yL/h，主通道进样口混合样品与宽支路注入口 PBS的流速优选为比值1:4-1:10。
[0022]步骤(5)中所述的明胶酶优选为基质金属蛋白酶9 (MMP-9)。
[0023]在步骤(4)中，含有肿瘤细胞的样品与经抗体修饰的S12OGel混匀孵育后流经主通道，同时将PBS从宽的支路向下注入主通道中，当其与样品接触时，挤压样品从下边窄支路流出，形成动态稳定的类层流界面。由于捕获有肿瘤细胞的二氧化硅微球(直径35-100 μ m)形变可忽略，且尺寸远大于窄的支路通道，其会从样品中分离出来进入PBS相，在右边主通道出口处收集起来，同时未被微球捕获的血细胞由于尺寸小于窄的支路通道，会被PBS挤压到下边窄的支路通道中，在下边出口处收集起来，完成肿瘤细胞筛选纯化过程。
[0024]所述的在微流控芯片中基于抗原抗体特异性识别和细胞尺寸分选肿瘤细胞的方法中，二氧化硅微球还可以替换成其他羟基微球，如聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)微球，相应的具有明胶表面的二氧化硅微球(S12OGel)、抗体修饰的S12OGel为具有明胶表面的聚甲基丙烯酸甲酯微球(PMMAOGel)、抗体修饰的PMMAOGel。
[0025]所述的在微流控芯片中同时利用抗原抗体特异性识别和细胞尺寸差别分选肿瘤细胞的方法，还包括对收集的肿瘤细胞进行鉴定的步骤。
[0026]本发明相对于现有技术具有如下优点和效果:
[0027](I)本发明用二氧化硅微球尺寸在50 μπι左右，远大于肿瘤细胞和正常血细胞的尺寸，且形变能力差，修饰上相应的抗体后对于靶细胞的捕获效率高，对一个微球而言只要捕获住一个靶细胞就能达到分选目的。用二氧化硅微球捕获肿瘤细胞，通过选择性的扩大肿瘤细胞分选物体的尺寸，大幅扩大了其与血细胞尺寸差异性，提高了肿瘤细胞的筛选纯度。
[0028](2)本发明用ant1-EpCAM修饰的S12OGel能特异性吸附靶细胞，而不吸附血细胞，从而实现了对CTCs的特异性识别和捕获。
[0029](3)本发明是同时结合了基于细胞尺寸和抗原抗体特异性识别，区分、筛选肿瘤细胞的方法。
[0030](4)本发明在二氧化硅微球表面包裹了一层明胶，在收集到捕获肿瘤细胞的二氧化硅微球后，通过明胶酶降解即可释放肿瘤细胞，释放的肿瘤细胞活性不受影响。
[0031](5)本发明所用微球能够对肿瘤细胞进行特异性识别和捕获，而不吸附血细胞，通过明胶酶降解释放下来的都是肿瘤细胞，进而可以实现对肿瘤细胞的可控释放。
[0032](6)本发明可以对释放下来的肿瘤细胞进行再培养，肿瘤细胞传代并未受到影响，且验证了肿瘤细胞相对血细胞极强的无限增殖