l能特异性吸附靶细胞，而不吸附血细胞。
[0067]实施例5
[0068]探宄流速对靶细胞分选效率的影响，具体操作为:修饰上抗体的S12OGel捕获住人造血中的CTCs后用注射泵将混匀液通入进样口①(见图2中①、②、③)中，同时将PBS通入入口②中，调节①和②两个入口注射泵的流速。例如，当将入口①处流速设定为70 μ L/小时，调节入口②处的流速，当②处流速比较低时，样品跟PBS的分界面比较靠近主通道出口处，导致含有白细胞的溶液不能完全从芯片窄支路(宽30 μ m)流出，分选纯度降低；随着②处流速的增加，分界面慢慢向入口①处靠近，含有白细胞的溶液能够完全从芯片的窄支路(宽30ym)流出，提高靶细胞的分选纯度。当②处PBS流速的增加到600 μ L/小时以上，PBS往入口①处涌出，样品很难往前推进，影响分选效果。PBS注入口②流速在300-600 μ L/小时时分选纯度最高。进样口①与PBS注入口②流速比值及PBS注入口②流速与靶细胞分选效率之间的关系见图9，当进样口①与PBS注入口②流速比值在1:4-1:10之间时分选纯度最高，即③处白细胞的过滤效果最好。
[0069]实施例6
[0070]在上述实施例4人造血CTCs捕获实验后(向ImL的健康人血样中加入经FDA染色的HCT116细胞悬液，配制成HCT116密度为100个/mL、250个/mL、500个/mL、1000个/mL的人造血样。加入20mg经ant1-EpCAM修饰过的S12OGel微球中，通过细胞混勾仪室温下搅拌30min，转速设定为1rpm)，通入分选芯片进行纯化后(如实施例5所述，将混合样品通过注射泵注入进样口①处，流速为70 μ L/小时；同时将PBS注入入口②处，流速为500 μ L/小时)，在主通道出口处收集S12OGel微球，放入0.5mL PBS配制的基质金属蛋白酶溶液(MMP-9，浓度为10nM)中浸泡30min降解二氧化硅微球表面的明胶，经过PBS多次冲洗离心收集释放下来的细胞。经统计靶细胞的释放效率为95%左右(图10)。
[0071]实施例7
[0072]将上述实施例6释放下来的细胞进行传代培养。离心收集后加入ImL细胞培养液放入24孔板中(孔槽中放置有玻璃基底)孵育lh、ld、2d、3d、7d观察释放后肿瘤细胞的生长状态。
[0073]释放后肿瘤细胞活性的测定:将不同培养期的细胞取出利用二乙酸荧光素(FDA)和碘化丙碇(PI)进行肿瘤细胞的双染色，观测细胞的活性。细胞浸泡在0.5mL FDA/PI (各5mg/mL溶解在PBS中)的混合溶液中，1min后用PBS洗涤，放在荧光显微镜下观察。其中FDA经蓝光激发呈绿色荧光，用于鉴定活细胞，PI经绿光激发呈红色荧光，用于鉴定死细胞。细胞的存活率的统计，是通过在Olympus IX 71显微镜下计数，归一化计算完成。实验数据表明不同培养时间的细胞活性均在95%左右(图11)，表明细胞捕获释放过程并未对细胞造成损伤，也未对细胞周期活动产出明显的影响(图12)。
[0074]实施例8
[0075]将上述实施例6释放下来的细胞分别培养I天、2天后使用三色荧光识别肿瘤细胞跟白细胞。
[0076]人造血中CTCs的检测:将上述不同孵育时间的肿瘤细胞利用一种三重免疫荧光识别方法进行鉴别。首先用PBS将上层培养液洗掉；然后加入4%多聚甲醛(PFA)溶液ImL对培养的细胞进行固定，静置10分钟，用PBS冲洗；接着加入0.1% Triton-XlOO溶液ImL对细胞进行穿孔，静置10分钟，用PBS冲洗，再加入3% BSA溶液0.5mL对非特异性位点进行包被，静置30分钟，用PBS冲洗；加入ant1-⑶45-FITC和anti_CK_PE荧光染料各0.1mL对细胞进行免疫荧光染色，并4°C下静置过夜；最后经DAPI染色后利用多通道荧光检测系统进行CTCs观测和计数。ant1-CD45-FITC在蓝光激发下发绿色荧光用于识别白细胞，ant1-CK-PE在绿光激发下发橙红色荧光用于识别肿瘤细胞，DAPI在紫外光激发下呈蓝色用于染细胞核(图13)。再结合肿瘤细胞与正常血细胞在尺寸上的差异，因此利用以上四种参量来对 CTCs 进行鉴别，原则如下:(I) CTCs (DAPI+/CK+/CD45-，10 μ m< 直径 <30 μ m) ； (2)白细胞(DAPI+/CK-/CD45+，直径 <16μπι) ； (3)红细胞(DAP1-/CK-/CD45-，直径〈7 μ m)。实验结果整理如图14，细胞分选前，加入的肿瘤细胞(HCT116)浓度为500/毫升，其中白细胞数量大约为16/毫升；经过S12OGel微球捕获、细胞分选芯片进行分选后，肿瘤细胞比值增长到80%左右；经过培养I天、2天后，白细胞数量几乎降为零。
【主权项】
1.一种在微流控芯片中同时利用抗原抗体特异性识别和细胞尺寸差别分选肿瘤细胞的方法，其特征在于包括如下步骤: (1)制备可进行尺寸分选的微流控芯片:该芯片主要包含一个宽度为300-800μ m的主通道，连接在主通道一侧的3-6条宽度为200-500 μ m的宽支路以及另一侧的10-25条宽度为20-30 μ m的窄支路； (2)在35-100μπι的二氧化硅微球表面包裹一层的明胶，得到具有明胶表面的二氧化硅微球S12OGel ； (3)在S12OGel的明胶表面修饰上具有特异性免疫识别肿瘤细胞功能的抗体，得到抗体修饰的S12OGel ； (4)将含有肿瘤细胞的样品与抗体修饰的S12OGel混匀孵育得混合样品，再通入微流控芯片的主通道，同时从宽支路注入PBS，分别在主通道的另一侧及窄支路收集捕获住肿瘤细胞的微球与未被微球捕获的细胞； (5)将收集的捕获住肿瘤细胞的微球用明胶酶进行降解释放肿瘤细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于: 步骤(I)中所述的微流控芯片为:高度100 μ m，主通道宽度550 μ m，4条宽度为400 μ m的宽支路，16条宽度为30 μ m的窄支路； 步骤(2)中所述的二氧化硅微球的粒径为50 μ m。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:步骤(2)包括如下步骤: 1)将二氧化硅微球加入到无水乙醇中，加热升温至50-80°C后滴入3-氨基丙基三乙氧基硅烷磁力搅拌2-4h，然后经过无水乙醇、去离子水离心洗涤后得到了氨基修饰的二氧化硅微球NH2-S12; 2)将册12^02重新分散到去离子水中，加入戊二醛，搅拌5-20h，然后经过去离子水离心洗涤后得到了醛基修饰的二氧化硅微球CHO-S12; 3)将010^02再次分散到去离子水中，加入明胶，搅拌3-5h后用去离子水离心洗涤得到表面均匀包裹上一层明胶的二氧化硅微球S12OGel。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:步骤(3)中所述的抗体为ant1-EpCAM。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(3)包括如下步骤: 1)将S12OGel浸泡在无水乙醇中进行消毒灭菌，再将S12OGel浸入(3-巯基丙基)三甲氧基娃烧中反应45-120分钟，再用无水乙醇洗涤； 2)将I)处理的微球浸入到GMBS溶液中反应45-60分钟，分别用无水乙醇、DMSO洗涤； 3)将2)处理的微球浸入链霉亲和素溶液中，4°C过夜处理，用PBS洗涤； 4)对3)处理的微球进行ant1-EpCAM修饰l_3h，用PBS洗涤得到抗体修饰的S12OGel。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:步骤⑷中所述的混合孵育的条件为通过细胞混匀仪室温下搅拌30min，转速设定为lOrpm。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:步骤(4)中主通道进样口混合样品的流速为70 yL/h，主通道进样口混合样品与宽支路注入口 PBS的流速为比值1:4_1:10。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:步骤(5)中所述的明胶酶为基质金属蛋白酶9。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:将所述的二氧化硅微球替换为其他羟基微球。
10.根据权利要求1-9任一项所述的方法，其特征在于:还包括对收集的肿瘤细胞进行鉴定的步骤。
【专利摘要】本发明公开了一种在微流控芯片中同时利用抗原抗体特异性识别和细胞尺寸差别分选肿瘤细胞的方法。本发明方法包括如下步骤：先在二氧化硅微球表面包裹一层明胶，再修饰上anti-EpCAM，然后与含有肿瘤细胞的样品混合孵育，孵育后的混合样品通过可进行尺寸分选的微流控芯片分选收集后，用明胶酶降解二氧化硅球表面的明胶即可释放收集的肿瘤细胞。本发明通过抗原抗体特异性识别选择性的扩大了吸附肿瘤细胞的微球与其他细胞的尺寸差别，分选效率及纯度更高，并且分选出来的肿瘤细胞能够被释放及培养，活性不受影响。本发明的分选过程不需要对芯片进行修饰，具有简单、方便、易操作、特异性强、成本低等优势，具有良好的应用前景。
【IPC分类】G01N33-569, C12N5-09
【公开号】CN104651315
【申请号】CN201510122414
【发明人】赵兴中, 国世上, 刘威, 黄琴琴
【申请人】武汉大学
【公开日】2015年5月27日
【申请日】2015年3月19日