一种高效合成乙烯的构建体及其构建方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因工程与生物合成领域，具体而言是一种高效合成乙烯的构建体及 其构建方法和应用。
【背景技术】
[0002] 能源危机与环境恶化是人类可持续发展所面临的核心问题。以石油、煤炭和天然 气为代表的化石能源的大量消耗，必将导致不可再生能源的枯竭以及由二氧化碳释放所引 起的气候变化，而以石油为主要原料的乙烯工业也将面临巨大挑战。乙烯是世界上产量最 大的化学产品之一，被大量用于聚乙烯、乙苯、聚苯乙烯以及乙醇等的生产，是一种很重要 的有机化工基本原料。因此，寻找一条可持续发展之路来解决石油资源匮乏对乙烯工业的 负面影响就成为学术界及工业界关注的重要课题。
[0003] 生物乙烯主要来源于植物、微生物和某些藻类。目前已经鉴定了至少三种乙烯合 成途径：（1)存在于植物体内的1-氨基环丙烷-1-羧酸（ACC)途径（MET-SAM-ACC-C2H4) (YangandHoffman, 1984) ; (2)存在于微生物体内的2-酮-4-甲基硫代丁酸（KMBA)途 径（MET-KMBA-C2H4)(K印czynskaetal.，2003) ;(3)主要存在于植物致病菌(如丁香假单 胞菌）中的ct-酮戊二酸（KGA)途径，该途径中的关键酶是乙烯合成酶（Ethyleneforming enZyme，EFE)，由efe基因编码，它可以直接将三羧酸（TCA)循环中的a-酮戊二酸（KGA)转 化为乙烯（Fukudaetal.，1992a;Fukudaetal.，1992b)。在这三种途径中，基于a-酮戊 二酸的乙烯合成途径备受关注，很多研究人员致力于通过基因工程及代谢途径改造的方法 将此途径引入到其他微生物体内合成乙烯。
[0004] 最早用于乙烯生物体内合成研究的微生物体系主要是以大肠杆菌、霉菌和酿酒酵 母为代表的异养微生物。Ishihara等人通过基因工程手段将乙烯合成酶基因efe导入大肠 杆菌BL2KDE3)中成功实现了EFE的体外表达，并合成了乙烯（Ishiharaetal.，1995);以 绿色木霉（Trichodermaviride)作为宿主菌，Tao等人将efe基因成功整合到其染色体上， 并证实纤维素可以有效诱导乙烯在该重组丝状真菌中的合成（Taoetal.，2008);此外，还 有在酿酒酵母中进行乙烯生物合成的相关报道，该研究将乙烯作为葡萄糖发酵的副产物释 放出来（I.Pirkovetal.，2008)。
[0005] 与以大肠杆菌、霉菌和酿酒酵母为代表的异养微生物相比，蓝细菌作为新一代能 源微生物系统正受到越来越多的关注（Angermayretal.，2009)。蓝细菌中乙烯合成的相 关研究最早是在模式藻株聚球藻PCC7942中开展的，通过引入基于a-酮戊二酸的乙烯合 成途径，日本的TakahiraOgawa实验室经过系列研究，最终得到了 451nl/ml/h/0D73(l的产 量（Fukudaetal.，1994;Sakaietal.，1997;Takahamaetal.，2003)。但是该实验的研究 发现，efe基因在聚球藻PCC7942中不稳定，基因自身携带的多个突变热点（hotspot)导致 所获得的基因工程菌株不能稳定合成乙烯；Ungerer等则以集胞藻（Synechocystissp.) PCC6803作为宿主菌，通过基因密码子优化、提高efe基因拷贝数和工程菌株培养条件优化 等操作使乙烯产量达到5650yL/L/h(Ungereretal.，2012)，该产量明显高于早期其他异 养微生物中的相关报道，这表明利用基因工程蓝细菌合成乙烯具有很大研发应用潜力。蓝 细菌是一类能够进行植物型产氧光合作用的原核微生物，它作为新一代能源微生物系统具 有以下优势：（1)蓝细菌能够吸收太阳能并固定二氧化碳作为碳源进行自养生长；（2)蓝细 菌是一类古老的微生物，已在地球上存在了几十亿年，他们对环境适应能力强，生长迅速； (3)蓝细菌遗传操作方便，遗传背景清晰，目前已经完成了 120余株藻株的全基因组测序工 作，这使得利用基因工程手段改造蓝细菌非常方便。
[0006] 集胞藻PCC6803是单细胞蓝细菌的代表物种，是一种淡水藻，其全基因组测序于 1996年完成，是最早完成全基因组测序的光合原核微生物，也是目前研究最多的蓝细菌之 一；聚球藻（Synechococcussp. )PCC7002是一种海水藻，生长迅速。集胞藻PCC6803和聚 球藻PCC7002都具备成熟的遗传操作体系，可以方便地进行外源基因的整合和内源基因的 敲除。
[0007] 蓝细菌因缺乏a-酮戊二酸脱氢酶系（0GDH)，其三羧酸循环多年来一直被认为是 不完整的。2011年science杂志报道了一项最新的研究成果，证实在聚球藻PCC7002中存 在a-酮戊二酸脱羧酶（0GDC)和琥珀酸半醛脱氢酶（SSADH)，分别由A2770和A2771两个 基因编码，这两个酶可以催化a-酮戊二酸经由琥珀酸半醛转化为琥珀酸，这一发现结束 了 40多年来人们对蓝细菌三羧酸循环的认识，为蓝细菌TCA循环相关的基础研究和应用研 究提供了新的认识（ZhangandBryant, 2011)。
【发明内容】
[0008] 本发明目的在于提供一种高效合成乙烯的构建体及其构建方法和应用。
[0009] 为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
[0010] 一种高效合成乙烯的构建体，构建体包含具有活性的启动子，以及该启动子控制 的乙烯合成酶基因（efe)。
[0011] 所述构建还包含有处于所述启动子上游的用于筛选蓝细菌转化体的标记基因。
[0012] 所述具有活性的启动子选自cpcB启动子、rbcL启动子、6803psbA2启动子、ci启 动子、7942psbA2启动子、7942psbAl启动子、psbD启动子、glnA启动子或groESL启动子。
[0013] 所述乙烯合成酶基因（efe)选自来源于丁香假单胞菌芝麻致病变种的efe基因、 来源于丁香假单胞菌大豆致病变种的efe基因、来源于丁香假单胞菌菜豆致病变种的efe 基因、来源于丁香假单胞菌麻致病变种的efe基因或来源于丁香假单胞菌豌豆致病变种的 efe基因。
[0014] 高效合成乙烯的工程菌，将所述构建体通过同源重组整合入集胞藻PCC6803的 slr0168基因、S111981基因和/或slr0370基因的内部；或，将所述构建体通过同源重组整 合入集胞藻PCC7002的A2770和/或A2771基因的内部。
[0015] 一种高效合成乙烯的工程菌的应用，所述工程菌在合成乙烯中的应用。
[0016] 将所述工程菌在利用太阳能固定二氧化碳合成乙烯。
[0017] 本发明以集胞藻PCC6803作为宿主菌构建一系列不同启动子驱动乙烯合成酶基 因表达的突变株，并从中筛选到可以高效驱动乙烯合成酶基因合成乙烯的启动子；而后将 筛选得到启动子驱动乙烯合成酶基因在在集胞藻PCC6803和聚球藻PCC7002的表达，并进 一步耦合乙烯生物合成途径与TCA循环，在集胞藻PCC6803的slll981、slr0370位点，以及 聚球藻PCC7002的A2770、A2771位点多拷贝表达乙烯合成酶基因，使TCA循环中间物a-酮 戊二酸在乙烯合成酶催化下，合成乙烯的同时完成到琥珀酸的转化，从而获得可以高效合 成乙烯的基因工程蓝细菌。
[0018] 利用上述获得的工程菌在光合微生物蓝细菌体内利用太阳能固定二氧化碳合成 乙烯，合成乙烯的能量来自于太阳能，碳源来自于二氧化碳。因此，利用这一技术制备生 物乙烯对缓解全球石油短缺对乙烯工业带来的负面影响具有重要意义，是可持续的生产方 法。
[0019] 进而利用上述光合微生物蓝细菌体内耦合乙烯生物合成途径与TCA循环，使TCA 循环中间物a-酮戊二酸在乙烯合成酶催化下，合成乙烯的同时完成到琥珀酸的转化，从 而获得乙烯。
[0020] 蓝细菌合成乙烯的机制如下：在蓝细菌的三羧酸循环中，由a_酮戊二酸到琥珀 酸的途径已被证实，即a-酮戊二酸在a-酮戊二酸脱羧酶(在聚球藻PCC7002中其编码基 因为A2770基因，参见例如NCBIID:CP000951. 1 ;在集胞藻PCC6803中依据序列比对推测 其编码基因为S111981，例如参见NCBIID:CP003265. 1;)的催化下转化为琥珀酸半醛，琥 珀酸半醛在琥珀酸半醛脱氢酶（；在聚球藻PCC7002中其编码基因为A2771基因，参见例如 NCBIID:CP000951. 1，在集胞藻PCC6803中依据序列比对推测其编码基因为slr0370,例 如参见NCBIID:CP003265. 1)的催化下转化为琥珀酸；野生型蓝细菌(例如集胞藻PCC6803 和聚球藻PCC7002)基因组中无乙烯合成酶基因类似物，通过以不同启动子驱动乙烯合成酶 基因（efe基因）在集胞藻PCC6803基因组中性位点slr0168中表达(例如使用基因工程方 法)，根据所合成的乙烯量可以筛选到一个高效驱动乙烯合成酶表达的启动子cpcB。此外， 以cpcB启动子驱动乙烯合成酶基因在聚球藻PCC7002和集胞藻PCC6803中表达，通过改造 三羧酸代谢途径(例如，通过在A2770和A2771位点表达乙烯合成酶基因，即表达乙烯合成 酶的同时敲除A2770基因和A2771基因；通过在S111981和slr0370位点表达乙烯合成酶 基因，即表达乙烯合成酶的同时敲除S111981基因和slr0370基因)和提高乙烯合成酶表达 量(提高基因拷贝数)，可以提高乙烯的产量。
[0021] 所述乙烯合成酶基因例如但不限于：来源于丁香假单胞菌芝麻致病变种的efe基 因(例如参见NCBIID:AB025277. 1);来源于丁香假单胞菌大豆致病变种的efe基因(例如 参见NCBIID:EF175870. 1);来源于丁香假单胞菌菜豆致病变种的efe基因(例如参见NCBI ID:D13182);来源于丁香假单胞菌麻致病变种的efe基因(例如参见NCBIID:AF101059. 1); 来源于丁香假单胞菌豌豆致病变种的efe基因(例如参见NCBIID:AF101061. 1)。另一个优 选的efe基因，具有如SEQIDNO: 1所示的序列。
[0022] 所述具有活性的启动子包括但不限于，例如cpcB启动子、rbcL启动子、6803psbA2 启动子、ci启动子、7942psbA2启动子、7942psbAl启动子、psbD启动子、glnA启动子和 groESL启动子。优选为cpcB启动子。
[0023] 所述用于筛选蓝细菌转化体的标记基因，例如卡那霉素抗性基因（NCBI ID:NC_003239. 1)，氯霉素抗性基因（NCBIID:NC_015291. 1)和壮观霉素抗性基因（NCBI ID:L05082))。所述标记基因可以位于所述在蓝细菌中具有活性的启动子的上游或下游。
[0024] 所述S111981基因具有SEQID N0:18所示的序列。
[0025] 所述基因slr0370的具有如SEQIDN0:19所示的序列。
[0026] 所述A2770基因具有SEQIDNO: 16所示的序列。
[0027] 所述基因A2771的具有如SEQIDNO: 17所示的序列。
[0028] 本发明的实施方案涉及在蓝细菌中合成并定量测定乙烯的方法，所述方法包括：
[0029] 1)将上述构建体导入集胞藻PCC6803或聚球藻PCC7002。
[0030] 2)培养步骤1)获得的蓝细菌。
[0031] 3)取一定量的2)的培养物，放于密闭玻璃瓶中放置一定时间，根据乙烯标准曲线 测定上空中的乙烯含量，可以得到培养物的乙烯合成速率。
[0032] 提高乙烯合成酶基因的拷贝数和优化基因工程藻的培养条件。
[0033] 相关术语
[0034] 在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术 人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的细胞培养、分子遗传学、核酸化学、有机化学实 验操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供 相关术语的定义和解释。
[0035] 如本发明中所使用的，"蓝细菌（Cyanobacterium)"是一类光合自养的原核微生 物，其能够利用太阳能，固定二氧化碳。蓝细菌也称为蓝藻。在本发明中，"蓝细菌"和"蓝 藻"可互换使用。
[0036] 如本发明中所使用的，载体（vector)是指能够将DNA片段(例如，目的基因）插入 其中从而允许将DNA(例如，目的基因）转移到受者细胞中的一种核酸运载工具。载体可以 通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的DNA片段在宿主细胞中获得表达。载体 是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒；噬菌体；柯斯质粒等等。
[0037] 如本发明中所使用的，乙烯合成酶（Ethylene-formingEnzyme)存在于一些 植物致病细菌和真菌中，可以催化三羧酸循环的中间物a-酮戊二酸转化为乙烯，并伴 随琥珀酸等的生成。编码乙烯合成酶的基因是本领域公知的，包括但不限于：来源于 丁香假单胞菌芝麻致病变种（Pseudomonassyringaepv.Sesami)的efe基因（例如参 见NCBIID:AB025277.1);来源于丁香假单胞菌大豆致病变种（Pseudomonassyringae pv.Glycinea)的efe基因（例如参见NCBIID:EF175870. 1);来源于丁香假单胞菌菜豆致病