QIDN0:32 :引物 PgroESL-1 的核苷酸序列。
[0117]SEQIDN0:33 :引物 PgroESL-2 的核苷酸序列。
[0118]SEQIDN0:34 :引物 PglnA-1 的核苷酸序列。
[0119]SEQIDN0:35 :引物 PglnA-2 的核苷酸序列。
[0120] SEQIDN0:36 :引物2770-1的核苷酸序列。
[0121] SEQIDN0:37 :引物2770-2的核苷酸序列。
[0122] SEQIDN0:38 :引物2771-1的核苷酸序列。
[0123]SEQIDN0:39:引物2771-2的核苷酸序列。
[0124]SEQIDN0:40:引物efe-1的核苷酸序列。
[0125]SEQIDN0:41:引物efe-6的核苷酸序列。
[0126]SEQIDN0:42:引物1981-1的核苷酸序列。
[0127]SEQIDN0:43:引物1981-2的核苷酸序列。
[0128]SEQIDN0:44:引物0370-1的核苷酸序列。
[0129]SEQIDN0:45:引物0370-2的核苷酸序列。
[0130] 实施例1:选择对乙烯合成酶基因
[0131] 为使乙烯合成酶基因（efe基因）在蓝细菌中的持续稳定表达，通过对比不同来源 的乙烯合成酶，最终选择了来源于丁香假单胞菌芝麻致病变种的可以高效合成乙烯的乙烯 合成酶基因，而后获得经过密码子优化以及屏蔽了突变热点（CTATG)的efe基因（参见例如 SEQIDNO:1)〇
[0132] 实施例2:用于以不同启动子驱动乙烯合成酶表达的载体的构建。
[0133] 为了实现以不同的启动子驱动乙烯合成酶（efe基因）在集胞藻PCC6803表达，如 下构建了以不同启动子驱动乙烯合成酶基因（efe基因)表达的表达质粒pXX29(P68Q3psbA1)、 pXX32 (P7942psbA1)、pXX33 (P7942psbA2)pXX47 (P聊B)、pXX48 (PrbcL)、pXX49 (Pci)、pXX50 (PpsbD)、 pXX53 (PglnA)、pXX54 (PgrQESL)。
[0134] 1?质粒pXX29 (P_3psbA1)、pXX32 (P7942psbA1)、pXX33 (P7942psbA2)的构建
[0135] 分别以pTZ32 (来源于pXT37b质粒(参见中国发明专利申请201010213758. 5)， 通过常规基因工程操作使含有7942psbAl启动子)、pTZ33 (来源于pXT37b质粒，通过常规 基因工程操作使含有7942psbA2启动子）和pTZ34 (来源于pXT37b质粒，通过常规基因工 程操作使含有6803psbA2启动子）为模板，分别以42psbAl-l(SEQIDN0:22)/42psbAl-2 (SEQIDN0:23)、42psbA2-l(SEQIDN0:24)/42psbA2-2(SEQID勵：25)和03?8匕八2-1 (SEQIDN0:20)/03psbA2-2(SEQIDN0:21)为引物进行PCR扩增（反应体系为 1XPCR Buffer, 2mMMgCl2, 200iiMdNTPs,引物各lOOpmol,DNA模板 50ng, 2. 5UDNA聚合酶；反应 程序为预变性95°C5min，变性95°C30s，退火55°C30s，延伸72°C，延伸时间视扩增片段长 度而定（lkb/min)，30个循环，最后72°C维持10min，4°C保温)，并将获得的PCR产物克隆到 pFL_XS(来源于pMD18_T商业载体（Takara,CatalogNo. :D1073A),通过常规基因工程操 作使含有EcoRI、Spel、Xbal酶切位点）载体上，分别得到载体pXX13、pXX14和pXX15。
[0136] 以pTZ35 (来源于pXT37b质粒，通过常规基因工程操作使含有efe基因）为模板， 以6€6-1(5￡010勵:40)和6€6-6(5￡010勵:41)为引物进行？〇?扩增（反应体系及反 应程序同前)，并将获得的PCR产物克隆到pFL-XS(来源于pMD18-T商业载体，通过常规基 因工程操作使含有EcoRI、Spel、Xbal酶切位点）载体上，得到载体pXX16。
[0137]使用EcoRI(Fermentas，No. :FD〇274)和Spel(Fermentas，No. :FD1254)分别酶 切载体pXX13、pXX14和pXX15,并分别回收约为236bp、88bp和318bp的DNA片段，分别得到 P7942PSM:启动子（SEQIDN0:8)、P7942psbA2(SEQIDN0:9)和P68〇3psbA2(SEQIDN0:7)启动子。 此外，使用EcoRI(Fermentas，No. :FD0274)和Xbal(Fermentas，No. :FD0684)酶切载体 PXX16,并回收约3. 8kb的DNA片段，然后使用连接酶将该3. 8kb的DNA片段分别与三个启 动子片段相连，分别得到以P7942psbA1驱动efe基因表达的质粒pXX17、以P7942psbA2驱动efe基 因表达的质粒pXX18和以P68(l3psbA2驱动efe基因表达的质粒pXX19。
[0138]使用EcoRI(Fermentas，No. :FD〇274)和Xbal(Fermentas，No. :FD〇684)分别酶 切载体pXX17、pXX18和pXX19,并分别回收约为4. 0kp、3. 9kp和4.lkp的DNA片段。此外， 使用EcoRI(Fermentas，No. :FD0274)和Spel(Fermentas，No. :FD1254)酶切载体pXT170S (来源于PMD18-T商业载体，通过常规基因工程操作使含有壮观抗性基因），并回收约1. 9kb 的DNA片段，得到壮观抗性基因（SEQIDNO:2)，然后使用连接酶将该壮观抗性基因分别与 三个DNA片段相连，分别得到带有壮观抗性标记的质粒pXX20、pXX21和pXX22。
[0139] 使用Smal (Fermentas，No. :FD〇664)、Spel (Fermentas，No. :FD1254)和PvuII (Fermentas，No. :FD0634)分别酶切质粒pXX20、pXX21和pXX22,并使用T4DNA聚合酶将 末端补平，然后分别回收约3. 2kb、3. lkb和3. 3kb的DNA片段。此外，使用Xbal酶切质粒 pXT22(来源于pUC9商业载体，通过常规基因工程操作使含有slr0168基因的上下游片段)， 并使用T4DNA聚合酶将末端补平，然后回收约4kb的DNA片段，然后使用连接酶将该4kb的 DNA片段分别与三个DNA片段相连，分别得到以P7942psbA1驱动efe基因表达的质粒pXX32、以 F*7942psbA2驱动efe基因表达的质粒PXX33和以P68(l3psbA2驱动efe基因表达的质粒pXX29。质 粒pXX29、pXX32、pXX33的基本结构示意图分别于图1、2、3中，其包含基因slr0168的上游 片段和下游片段，以及分别以P_3psbA2、P7942psbA1、P_3psbA2启动子驱动efe基因表达的片段。
[0140] 2?载体pXX46的构建
[0141]使用Ndel(Fermentas，No. :FD0584)和Xhol(Fermentas，No. :FD0694)酶 切pTZ35，回收约为1.lkb的efe基因片段。此外，使用NdeI(Fermentas，No.: FD0584)和Xhol(Fermentas，No. :FD0694)酶切质粒pXT37b(参见中国发明专利申 请201010213758. 5)，并回收大的DNA片段，该DNA片段包含有slr0168两端同源 臂-Omega-PpetE，PpetE两侧分别带有Kpnl和Ndel酶切位点。然后使用连接酶将所获得的 两个DNA片段相连，从而得到携带有efe基因的质粒pXX46,质粒pXX46的基本结构示于图 4中，其包含efe基因（SEQIDN0:1)。
[0142] 3?质粒pXX47 (PcpcB)和pXX50 (PpsbD)的构建
[0143] 使用Kpnl (Fermentas，No. :FD〇524)和Ndel (Fermentas，No. :FD〇584)酶切载 体pXX46,并回收去除PpetE后的大片段。使用Kpnl和Ndel分别酶切质粒pZZ008(来源于 PMD18-T商业载体，通过常规基因工程操作使含有cpcB启动子）和质粒pFQ30C(来源于 pXT37b，通过常规基因工程操作使含有psbD启动子)，分别回收约600bp和900bp的片段， 分别为〇?(^启动子（5￡0 10勵：10)和？此0启动子（5￡0 10勵：13)。然后使用连接酶将 所获得的大片段分别与两个启动子片段相连，从而分别得到以P。^驱动efe基因表达的质 粒PXX47和以PpsbD驱动efe基因表达的质粒pXX50,质粒pXX47和质粒pXX50的基本结构 分别示于图5和图8中。
[0144] 4?质粒pXX48 (PAcl)和pXX49 (Pci)的构建
[0145] 使用Kpnl (Fermentas，No. :FD0524)酶切载体pXX46,并使用T4DNA聚合酶将末端 补平，然后使用Ndel (FermentaS，N〇. :FD0584)酶切补平后的片段，回收去除？_￡后的大片 段。使用BglII(Fermentas，No. :FD0084)分别酶切质粒pLX89(来源于pGEMT-easy商业载 体（Promega，Catalog No. :AB1360)，通过常规基因工程操作使含有rbcL启动子)和pZZ019 (来源于PMD18-T商业载体，通过常规基因工程操作使含有ci启动子)，并使用T4DNA聚合 酶将末端补平，然后使用Ndel (Fermentas，No. :FD0584)酶切补平后的片段，分别回收约 1.3吐和8(^口的片段，得到吐(^启动子（5￡〇10勵：11)和(^启动子（5￡〇10勵：12)片 段。然后使用连接酶将所获得的大片段分别与两个启动子片段相连，从而分别得到以Prtcl 驱动efe基因表达的质粒pXX48和以Pei驱动efe基因表达的质粒pXX49,质粒pXX48和质粒 PXX49的基本结构分别示于图6和图7中。
[0146] 5?质粒pXX53 (PglnA)的构建
[0147]以鱼腥藻PCC7120 基因组DNA为模板，以PglnA-1(SEQIDN0:34)和PglnA-2 (SEQID勵:35)引物进行？0?扩增（反应体系及反应程序同前)，并将获得的？0?产物克隆 到pFL-XS(来源于pMD18-T商业载体，通过常规基因工程操作使含有EcoRI、SpeI、XbaI酶 切位点）载体中，得到载体PXX52。
[0148]使用Kpnl(Fermentas，No. :FD〇524)和Ndel(Fermentas，No. :FD〇584)酶切 载体pXX46,并回收去除PpetE后的大片段。使用Kpnl(Fermentas，No. :FD0524)和Ndel (Fermentas，No. :FD0584)酶切载体pXX52,并回收约380bp的片段，然后使用连接酶将所获 得的两个片段相连接，从而得到质粒PXX53。质粒pXX53的基本结构分别示于图9中。
[0149] 6?质粒pXX54 (PgMEa)的构建
[0150]以聚球藻PCC7942基因组DNA为模板，以PgroESL-l(SEQ ID N0:32^PPgroESL-2 (SEQ ID勵:33)引物进行？0?扩增（反应体系及反应程序同前)，并将获得的？0?产物克隆 到pFL-XS(来源于pMD18-T商业载体，通过常规基因工程操作使含有EcoRI、SpeI、XbaI酶 切位点）载体中，得到载体PXX51。
[0151]使用Kpnl(Fermentas，No. :FD〇524)和Ndel(Fermentas，No. :FD〇584)酶切 载体pXX46,并回收去除PpetE后的大片段。使用Kpnl(Fermentas，No. :FD0524)和Ndel (Fermentas，No. :FD0584)酶切载体pXX51，并回收约240bp的片段，然后使用连接酶将所获 得的两个片段相连接，从而得到质粒PXX54。质粒pXX54的基本结构分别示于图10中。
[0152] 实施例3 :用于以PepeB驱动efe在集胞藻PCC6803的S111981和slr0370位点表 达的相关载体的构建
[0153] 为了证实在slll981和slr0370位点整合乙烯合成酶对合成乙烯的影响，并证实 可以通过提高efe基因拷贝数来提高乙烯合成酶的表达量，从而提高乙烯的产量，如下构 建了用于将由Pepc;B驱动的乙烯合成酶基因（efe基因)整合入PCC6803基因组中S111981位 点的载体PXX64,以及用于将由PepeB驱动的乙烯合成酶基因（efe基因）整合入PCC6803基 因组中slr0370位点的载体pXX65。
[0154] 1 ?载体PXX64的构建
[0155]以集胞藻PCC6803 基因组DNA为模板，以 1981-1(SEQIDN0:42)和 1981-2(SEQ IDN0:43)引物进行PCR扩增（反应体系及反应程序同前)，并且根据生产商的说明书，将获