一种利用CRISPR/Cas系统在猪胚胎细胞中实现基因敲除的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种利用CRISPR/Cas系统在猪胚胎细 胞中实现基因敲除的方法。
【背景技术】
[0002] 传统的基因打靶技术，通过构建同源打靶载体，依赖同源重组（HR)来实现对内源 基因的定点敲除，其效率非常低，这极大地限制了各类动物模型的建立及分子机制的研宄。 ZFN的研宄，是基因编辑技术的一场革命。ZFN通过特异性地切割DNA，造成DSBs，从而引 发细胞自身DNA修复途径一一非同源性末端连接（NHEJ)，NHEJ通过随机而的删除/插入 (Indel)修复DNA，使得目的基因发生突变。ZFN将传统基因打靶的效率从10_6提高至20%， 但是其结构的特殊性，及其靶点筛选、载体构建的复杂性，限制其在大范围内的使用。TALEN 是继ZFN后出现的又一种基因编辑技术，其以高效、构建简单、靶点选择范围广等特点，而 备受研宄人员的亲睐。
[0003] TALEN的出现，使得各种基因敲除的动物及细胞系迅速涌现。而研宄人员一直致力 于寻找一种更为简易的方法，应用于基因工程。2013年1月份，SCIENCE同时刊登了两篇关 于CRISPR/Cas在基因敲除上的应用的文章，这种构建快速、结构简单，高效的分子工具很 快便被大家所接受。拟南芥，果蝇，斑马鱼，老鼠，人的细胞等等，各种基因敲除的个体或者 细胞如雨后春笋般涌现。
[0004] CRISPR/Cas系统如图1所示，主要包括两部分：Cas9蛋白和crRNA:tracrRNA。 Cas9蛋白的作用主要是对DNA实行切割，造成DSBs;而crRNA:tracrRNA主要是特异性结合 DNA，并引导Cas9对DNA进行切割。crRNA:tracrRNA经过改造，形成更容易构建的嵌合体 RNA，也称引导RNA(GuideRNA，gRNA)而其效率并不受影响。这门技术已经越来越广泛地被 大家所接受和利用。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于公开了一种利用CRISPR/Cas系统在猪胚胎细胞中实现基因敲 除的方法。
[0006] 本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
[0007] 一种利用CRISPR/Cas系统在猪胚胎细胞中实现基因敲除的方法，包括下述步骤：
[0008] (1)、构建Cas9 真核表达载体pCDNA3. 1 (+) -hCas9-NLS;
[0009] (2)、构建gRNA表达载体pSicoR-GFP-T7-gRNA;
[0010] (3)、将目的基因靶序列插入gRNA表达载体pSicoR-GFP-17-gRNA中；
[0011] (4)、将步骤⑴构建的p⑶NA3. 1⑴-hCas9-NLS和步骤（3)的产物用限制性内切 酶线性化，再以线性化的质粒为模板进行体外转录，体外转录分别获得hSpCas9的mRNA和gRNA2#的sgRNA，最终将hSpCas9的mRNA和gRNA2#的sgRNA通过显微注射至猪IVF胚胎 的胞质中，实现敲除。
[0012] 上述技术方案所述的利用CRISPR/Cas系统在猪胚胎细胞中实现基因敲除的方 法，其中，步骤（1)的具体过程为：合成hSpCas9DNA序列，并在C端加入一段NLS，将其克 隆到PCDNA3. 1 (+)真核表达载体，得到Cas9真核表达载体pCDNA3. 1 (+)-hCas9-NLS。
[0013] 上述技术方案所述的利用CRISPR/Cas系统在猪胚胎细胞中实现基因敲除的方 法，其中，步骤（2)的具体过程为：
[0014] (a)、合成gRNA，合成的两条DNA链，溶解后，各取5yL，再加入lyL10XLAPCR Buffer(Takara)，混匀，95°C加热lOmin，然后置于室温lh，形成带有两个粘性末端的DNA双 链；
[0015] (b)、pSic〇R-GFP载体用Xhol和BamHI酶切，回收载体骨架，然后将步骤⑴所得 DNA双链克隆到pSicoR-GFP中，得到pSicoR-GFP-gRNA;
[0016](c)、以pSicoR-GFP-gRNA为模板，以I7-gRNA_F、I7-gRNA_R为引物进行PCR反 应；将PCR产物，克隆至pMD18-T载体，得到pMD18-T-T7-gRNA;将pMD18-T-T7-gRNA和 pSicoR-GFP载体同时用Xhol和BamHI进行酶切，回收120bp和7. 5kb的DNA条带，然后将 回收的两段DNA进行连接；连接产物进行转化导入感受态细胞，挑取单克隆细胞菌落，扩大 培养，提取质粒pSicoR-GFP-T7-gRNA。
[0017] 上述技术方案所述的利用CRISPR/Cas系统在猪胚胎细胞中实现基因敲除的方 法，其中，步骤（3)中目标基因序列为ATATGGGAAAATTCCAGCCA，步骤（3)的具体过程为：
[0018] ①、将目的基因靶序列退火组装成DNA双链；
[0019] ②、再将pSicoR-GFP-T7-gRNA载体用BsmBI进行酶切，反应体系为： pEASY-hU6-gRNA质粒 2yg，10XNEBBuffer3 2yL，0? 5yLBsmBI，加水至 20yL，55°C孵育 3h;将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，将约7500bp的目的片段回收，测定浓度，存于-20°C， 备用；
[0020] ③、将步骤①和②的产物进行连接，连接体系：1yLT4ligase(Fermentas)，2yL 10XT4ligaseBuffer(Fermentas)，BsmBI酶切的pEASY_hU6_gRNA载体 30ng，革E序列及其 互补序列形成的双链DNA5yL，加水至20yL，16°C过夜连接。将连接产物导入感受态细胞 DH5a进行转化，扩大培养，提取质粒，得到将目的基因靶序列插入pSicoR-GFP-T7-gRNA后 的载体。
[0021] 本发明具有以下有益效果：
[0022] 1、所针对的物种不同，猪等大家畜哺乳动物，其基因组比低等的模式生物更加复 杂，所以相对来说，要得到基因敲除的细胞或者胚胎比较困难，目前利用CRISPR/Cas9系统 在大家畜上应用的报道还比较少；
[0023] 2、利用RGS-CR报告载体筛选有效的gRNA靶点序列，能够获得效果最佳的靶点序 列，提尚基因敲除的可彳丁性；
[0024] 3、突变检测的方法不同，一般文献所报道的检测CRISPR/Cas9系统引起的突变， 都是利用T7核酸内切酶（T7E1)其价格比较昂贵，而利用本发明的检测方法，利用12%的聚 丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE)，更加敏感有效且成本低，适合更广范围使用。
【附图说明】：
[0025] 1、图1为CRISPR/Cas系统示意图；
[0026] 2、图 2 为pCDNA3. 1(+)-hSpCas9-NLS质粒结构示意图；
[0027] 3、图3为pEASY-hU6_gRNA质粒结构示意图；
[0028] 4、图 4 为pSicoR-GFP-T7-gRNA质粒结构示意图；
[0029] 5、图5为1#靶点RGS-CR检测的荧光图；
[0030] 6、图6为2#靶点RGS-CR检测的荧光图；
[0031] 7、图7为单个胚胎PCR产物12%聚丙烯酰胺凝胶电泳图；
[0032] 8、图8为测序得到的靶基因的定点突变；
[0033] 9、图9为单个胚胎PCR产物12%聚丙烯酰胺凝胶电泳图；
[0034] 10、图10为测序得到的靶基因的定点突变。
【具体实施方式】：
[0035] 为使本发明的技术方案便于理解，以下结合具体试验例对本发明一种利用 CRISPR/Cas系统在猪胚胎细胞中实现基因敲除的方法作进一步的说明。
[0036] 实验例1 :一种利用CRISPR/Cas系统在猪胚胎细胞中实现基因敲除的方法：
[0037] 本发明提供了利用CRISPR/Cas系统在猪胚胎细胞中实现基因敲除的方法，通过 将Cas9mRNA和特定的sgRNA注入猪的胚胎，得到基因突变的胚胎，包括以下步骤：
[0038]-、Cas9真核表达载体及嵌合体gRNA的构建：
[0039] 1、Cas9真核表达载体的构建：
[0040] 其中的Cas9是根据streptococcus pyogenes Cas9基因序列，进行人源密码 子优化后，合成hSpCas9 DNA序列，并在C端加入一段NLS，将其克隆到pCDNA3. 1(+)真 核表达载体，得到P⑶NA3. l(+)-hSpCas9-NLS(结构示意图如图2所示）；本实施例中的 p⑶NA3. l(+)-hSpCas9-NLS由北京唯尚立德生物科技有限公司惠赠或从该公司购买获得；
[0041] 2、嵌合体gRNA的构建：
[0042](1)、将102bp的gRNA序列，及其互补链，gRNA序列及其互补链中均包括3'端的 转录终止信号，两端分别包括Xhol和BamHI粘性末端（在gRNA合成时自动形成），另外，在 gRNA5'端引入两个BsmBI酶切位点，用于靶序列的插入，送至生工生物工程（上海）股份 有限责任公司合成，其中102bp的gRNA序列如SEQNo.ID1所示，其互补序列如SEQNo.ID2 所示；
[0043] gRNA合成之后进行退火，得到DNA双链，将DNA双链克隆至pSicoR-GFP;具体步骤 为：将合成的两条DNA链，溶解后，各取5yL，再加入lyL10XLAPCRBuffer(Takara)，混 匀，95°C加热10min，然后置于室温lh，形成带有两个粘性末端的DNA双链。将pSicoR-GFP 载体用Xhol和BamHI酶切，回收载体骨架，然后将gRNA双链克隆到pSicoR-GFP中，命名为 pSicoR-GFP-gRNA。这一步的目的主要是为了获得大量的gRNA片段，使后面将hU6与gRNA 连接在一起更为简单。
[0044](2)、以人的基因组为模板，利用引物hU6_F (SEQ No.ID3所示）和hU6_R (SEQ No.ID4所示），进行第一次PCR反应得到人的U6启动子序列，对PCR产物进行琼脂糖凝胶 电泳检测，得到约250bp的DNA条带即为人的U6启动子序列；其中
[0045]PCR反应体系为：2XPremix LATaq(Takara) 10 1^，汕6_卩、仙6_1?各1 yL，人的基 因组DNA lOOng，加超纯水至20 y L;
[0046]PCR反应程序为：95°C预变性 3min;95°C变性 30sec，60°C退火 30sec，72°C延伸 30sec，35个循环，再延伸3min;4°C终止反应；
[0047](3)、然后以pSicoR-GFP-gRNA为模板，以gRNA_F(SEQNo.ID5 所示）、gRNA_R(SEQ No.ID6所示）为引物，进行第二次PCR反应得到gRNADNA片段；对PCR产物进行琼脂糖凝 胶电泳，得到约l〇〇