#靶点序列继续 后面的实验。（pCDNA-hSpCas9-NLS和pEASY-hU6-gRNA载体由前面步骤所构建，RGS-CR报 告载体购自与ToolGen)
[0072] 三、将Cas9mRNA和sgRNA注入猪的胚胎实行基因敲除：
[0073] (i)将之前合成的带有BsmBI粘性末端的2#靶点序列退火组装成DNA双链，方 法同步骤（b);
[0074] (ii)、再将pSic〇R-GFP-T7-gRNA载体用BsmBI进行酶切，反应体系及方法同 步骤（b)。将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，将约7500bp的目的片段回收，测定浓度，存 于-20°C，备用；
[0075] (iii)、将步骤（i)和（ii)的产物进行连接，连接与转化体系同步骤（b)，将克 隆的到的载体命名为pSicoR-GFP-T7-gRNA2# ;
[0076] (iv)、用限制性内切酶Drain和Psil分别将pCDNA-hSpCas9-NLS质粒和 pSicoR-GFP-T7-gRNA2# 质粒线性化；其中，
[0077]pCDNA-hSpCas9-NLS质粒的酶切反应体系为：pCDNA-hSpCas9-NLS质粒 10y g，限 制性内切酶Drain5yL(Fermentas)，10XBufferG10uL，加超纯水至 100yL;酶切反 应条件为37°C反应6h;
[0078]pSicoR-GFP-T7-gRNA2# 质粒的酶切反应体系为pSicoR-GFP-T7-gRNA2# 质粒 10Ug，限制性内切酶Psil(NEB) 5yL，lOXCutSmartBuffer10yL，加超纯水至 100yL，酶 切反应条件为37°C反应6h;
[0079] (v)、将线性化的质粒经过乙醇沉淀后，用于体外转录；乙醇沉淀步骤：在酶切产 物中，加入0. 1倍体积的醋酸钠（3M，PH= 5. 2)，混匀；再加入2倍体积预冷的无水乙醇，混 勾，置于-20°〇30111；[11;12,000\8离心10111；[11，去除上清，加入1111170%乙醇，12,00(^离心 2min，去除上清，置于超净工作台风干，加超纯水溶解4h以上，备用；
[0080]再用体外转录试剂盒mMESSAGEmMACHINE?T7Kit(Ambion)和 MEGAshortscript? 17Kit(Ambion)，根据试剂盒提供的操作步骤，分别体外转录得到Cas9 的mRNA及gRNA的sgRNA。以Cas9:gRNA= 100:50的比例，将二者的混合物注入孤雌激活 胚胎和IVF胚胎。共注射孤雌胚胎80个，注射IVF胚胎52个。
[0081] 四、突变胚胎的检测：
[0082] 此步主要是检测CRISPR/Cas系统介导的猪胚胎⑶F8基因的敲除效率，具体步骤 为：
[0083] 注射Cas9-gRNAmRNA和sgRNA的胚胎，培养7天后，将发生卵裂的胚胎，单个分别 放入装有8yL纯水的PCR管中，利用巢式PCR，扩增靶点附近~300bp的DNA片段；
[0084] 巢式反应的步骤为：
[0085] 第一次PCR反应体系：10yL2XPremixLATaq(Takara)，上下游引物各 1yL。反 应程序：95°C预变性5min，95°C变性30sec，60°C退火30sec，72°C延伸30sec，72°C再延伸 3min，4°C终止反应。
[0086] 第二次PCR取第一次PCR产物1 y L，第二次PCR引物上下游各1 y L， 10yL2XPremix LA Taq(Takara)，加水至20yL，反应程序与第一次PCR程序一致。所用引 物如下：
[0087]序列 21:ITITGGATGGGACTGGATTAIT(SEQ No.ID21)
[0088]序列 22:TTATTGTATGATTTGTTTTGATGGT(SEQ No.ID22)
[0089]序列 23:TGGATGGGACTGGATTAITGC(SEQ No.ID23)
[0090]序列 24:GCCAACCATTGCATATATTCTCT(SEQ No.ID24)
[0091]序列 25:CAAAAATACCCTCACACTCATCT(SEQ No.ID25)
[0092]序列 26:AAGTGACTGTAGCATACTCCAGG(SEQ No.ID26)
[0093] 巢式反应的步骤步骤中，孤雌激活的胚胎检测时第一次PCR反应的上游引物为序 列21、下游引物为序列22;第二次PCR反应的上游引物为序列23、下游引物为序列24;
[0094]IVF胚胎检测时第一次PCR反应的上游引物为序列23、下游引物为序列24;第二 次PCR反应的上游引物为序列25、下游引物为序列26。孤雌激活胚胎和IVF胚胎两次检测 的反应体系及程序除引物不同外，其余均一样。
[0095]取上述巢式PCR反应的5yLPCR产物，直接用12%的聚丙烯酰胺凝胶电泳，电 压150V，时间约2h。在PCR过程当中，当有野生型和突变型两种模板链存在的情况下，最 后得到的PCR产物，有一部分会形成杂合链，杂合链有一定的高级结构，这使得其在电泳过 程中，其迀移的速率比纯合链要慢，利用高分辨率的聚丙烯酰胺凝胶电泳，可以分辨出杂合 链，从而鉴定是否有突变发生。将疑似突变的PCR产物，回收，连接，转化，挑取单克隆，进行 测序。共收集检测80个孤雌激活的胚胎，突变3个，突变率为3. 75%。检测了 52个IVF胚 胎，突变12个，突变率为23%。
[0096]Cas9-gRNAmRNA注射孤雌激活胚胎突变检测结果见图7和图8,其中图7为单个 胚胎PCR产物12%聚丙烯酰胺凝胶电泳图，图8为测序得到的靶基因的定点突变。
[0097]Cas9-gRNAmRNA注射IVF胚胎突变检测结果见图9和图10,其中图9为单个胚胎PCR产物12%聚丙烯酰胺凝胶电泳图，图10为测序得到的靶基因的定点突变。
[0098]以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何形式上和实质上的限 制，凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用以上所揭示的技 术内容，而作出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依 据本发明的实质技术对以上实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本 发明的技术方案的范围内。
【主权项】
1. 一种利用CRISPR/Cas系统在猪胚胎细胞中实现基因敲除的方法，包括下述步骤： (1) 、构建 Cas9 真核表达载体 pCDNA3. l-hCas9-NLS ; (2) 、构建 gRNA 表达载体 pSicoR-GFP-T7-gRNA ; (3) 、将目的基因靶序列插入gRNA表达载体pSic〇R-GFP-T7-gRNA中； (4) 、将步骤（1)构建的pCDNA3. l-hCas9-NLS和步骤（3)的产物用限制性内切酶线性 化，再以线性化的质粒为模板进行体外转录，体外转录分别获得hSpCas9的mRNA和gRNA2# 的sgRNA，最终将hSpCas9的mRNA和gRNA2#的sgRNA通过显微注射至猪IVF胚胎的胞质 中，实现敲除。
2. 根据权利要求1所述的利用CRISPR/Cas系统在猪胚胎细胞中实现基因敲除的方法， 其特征在于：步骤（1)的具体过程为：合成hSpCas9 DNA序列，并在C端加入一段NLS，将其 克隆到PCDNA3. 1真核表达载体，得到Cas9真核表达载体pCDNA3. l-hCas9-NLS。
3. 根据权利要求1所述的利用CRISPR/Cas系统在猪胚胎细胞中实现基因敲除的方法， 其特征在于，步骤（2)的具体过程为： (a) 、合成gRNA，合成的两条DNA链，溶解后，各取5yL，再加入IyL IOXLA PCR Buffer (Takara)，混匀，95°C加热lOmin，然后置于室温lh，形成带有两个粘性末端的DNA双 链； (b) 、pSicoR-GFP载体用XhoI和BamHI酶切，回收载体骨架，然后将步骤（1)所得DNA 双链克隆到 PSicoR-GFP 中，得到 pSicoR-GFP-gRNA ; (c) 、以 pSicoR-GFP-gRNA 为模板，以 T7-gRNA_F、T7-gRNA_R 为引物进行 PCR 反应；将 PCR 产物，克隆至 pMD18-T 载体，得到 pMD18-T-T7-gRNA ;将 pMD18-T-T7-gRNA 和 pSicoR-GFP 载体同时用XhoI和BamHI进行酶切，回收120bp和7. 5kb的DNA条带，然后将回收的两段 DNA进行连接；连接产物进行转化导入感受态细胞，挑取单克隆细胞菌落，扩大培养，提取 质粒 pSicoR-GFP-T7-gRNA。
4. 根据权利要求1所述的利用CRISPR/Cas系统在猪胚胎细胞中实现基因敲除的方法， 其特征在于，步骤（3)中目标基因序列为ATATGGGAAAATTCCAGCCA，步骤（3)的具体过程为： ① 、将目的基因靶序列退火组装成DNA双链； ② 、再将pSicoR-GFP-T7-gRNA载体用BsmBI进行酶切，反应体系为：pEASY-hU6-gRNA 质粒2以8，10\册881^€613 2以1^，0.5以1^8811^1，加水至2(^1^，55°〇孵育311;将酶切产物 进行琼脂糖凝胶电泳，将约7500bp的目的片段回收，测定浓度，存于-20°C，备用； ③ 、将步骤①和②的产物进行连接，连接体系：IyL T4 Iigase(Fermentas)，2yL 10 X T4 ligase Buffer (Fermentas)，BsmBI 酶切的 pEASY_hU6_gRNA 载体 30ng，革E序列及其 互补序列形成的双链DNA 5 μ L，加水至20 μ L，16°C过夜连接。将连接产物导入感受态细胞 DH5 α进行转化，扩大培养，提取质粒，得到将目的基因靶序列插入pSicoR-GFP-T7-gRNA后 的载体。
【专利摘要】本发明一种利用CRISPR/Cas系统在猪胚胎细胞中实现基因敲除的方法，包括下述步骤：构建Cas9真核表达载体；构建gRNA表达载体；将目的基因靶序列插入gRNA表达载体中；将Cas9真核表达载体和插入了目的基因的插入gRNA表达载体用限制性内切酶线性化，再以线性化的质粒为模板进行体外转录，体外转录分别获得hSpCas9的mRNA和gRNA2#的sgRNA，最终将hSpCas9的mRNA和gRNA2#的sgRNA通过显微注射至猪IVF胚胎的胞质中，实现敲除。本发明的方法具有更加敏感有效且成本低，适合更广范围使用的优点。
【IPC分类】C12N15-85, C12N15-11, C12N5-10
【公开号】CN104651399
【申请号】CN201410849158
【发明人】刘庆友, 石德顺, 粟小平, 刘帅, 朱鹏, 冯万有, 崔奎青
【申请人】广西大学
【公开日】2015年5月27日
【申请日】2014年12月31日