甘露聚糖肽原料药的制备工艺及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及药物领域，具体涉及甘露聚糖肽原料药的制备工艺及其应用。
【背景技术】
[0002] 甘露聚糖肽，曾用名多抗甲素，是由链长有所差异的甘露聚糖肽分子构成的混合 物，结构中含有39 :1的甘露糖与葡萄糖，蛋白质的含量在4. 5°/『6. 2%之间，游离的氨基酸和 小分子糖均不存在于甘露聚糖肽分子中。蛋白质中存在的主要氨基酸成分为天门冬氨酸、 苏氨酸、丝氨酸等。甘露聚糖肽是无定形的粉末，颜色为微黄色或类白色，化学性质稳定，易 溶于水而不溶于有机溶剂。
[0003] 目前，市场上出售的甘露聚糖肽产品是a ~溶血性链球菌33#菌株经深层培养，提 取精制所获得的，其中，a ~溶血性链球菌33#菌株来自于健康人的口腔，化学成分分析为 a~甘露聚糖肽。
[0004] 通常情况下，a ~溶血性链球菌的发酵产物中甘露聚糖肽是重均分子量在1~1〇〇 万的甘露聚糖肽混合物，经研究者发现，通过截流法得到的重均分子量为1~20万的甘露 聚糖肽的药理活性比原有重均分子量的甘露聚糖肽高，成分更加清楚且疗效较好。因此， 采用截流法制备甘露聚糖肽。其制备方法主要包括发酵、提取、分离及干燥等步骤，例如： CN101186941B公开了一种高纯度甘露聚糖肽的制备方法，包括如下步骤：制备发酵产物， 提取及粗品的制备，大分子甘露聚糖肽的分离，大分子甘露聚糖肽的水解。该发明经过超 滤、水解步骤，制备的甘露聚糖肽纯度高，可达90~98%。CN1172952C公开了一种甘露聚糖 肽组合物及其制备工艺和用途。甘露聚糖肽组合物为a~溶血性链球菌的发酵产物，主要 由甘露聚糖肽组成，重均分子量1~20万；其制备方法包括下列步骤：以a ~溶血性链球菌 为生产菌种进行发酵；从发酵液提取甘露聚糖肽；进一步分离得到重均分子量1~20万，分 子量分布系数在4. 0以下的甘露聚糖肽。
[0005] a ~甘露聚糖肽以甘露聚糖、碱性多肽及甘露寡糖的形式产生生理作用。
[0006] (1)甘露聚糖的功能 a、甘露聚糖可以吸附病原菌。低聚甘露糖和沙门氏菌一起培养能够出现凝集现象，阻 断病原菌的致病过程。寡聚糖与病原菌产生凝集素结合具有特异性。这一结论是相关研究 者研究甘露聚糖肽对肉鸡沙门氏菌感染能力的影响时发现的。b、可以为有益菌提供营养。 有益菌能够特别好的与甘露寡糖中的a~l，4糖苷键结合，使得有益菌快速大量的繁殖；甘 露寡糖中的a~l，4糖苷键不能被有害菌利用，有害菌因此无法生长繁殖而死亡。c、可以调 节免疫功能。研究表明，甘露聚糖发挥免疫调节作用是由于其分子中的磷酸成分，磷酸成分 在免疫调节功能中可以起到重要作用。肿瘤坏死因子具有抑制肿瘤细胞的作用，白细胞介 素具有免疫活性，肿瘤细胞可以被一氧化氮直接杀死，而上述三种因素可以在低聚甘露糖 的影响下而被刺激增多。低聚甘露糖中的磷酸成分很高时，血清中的溶菌酶水平也同时有 所提高。d、结合霉菌毒素能极大降低动物营养成分，而酯代葡甘露聚糖是一种较好的霉菌 毒素结合剂。试验证明，甘露聚糖可以减少霉菌素对人及动物的毒副作用，使霉菌素的免疫 抑制作用有所降低。e、在较低pH值的环境下，不利于肠道中的有害菌的生长繁殖。但甘露 寡糖通过发酵生成的短链脂肪酸会降低消化道的酸碱值，所以，有害菌不能生长。甘露寡糖 产生的短链脂肪酸同时可以增强消化道的蠕动，使营养物质能够充分被消化利用。
[0007] (2)碱性多肽的功能 碱性多肽的功能肽生理学作用颇多。肽聚糖是细菌的细胞壁成分，细胞壁中的聚糖链 是通过N~乙酰葡胺与N~乙酰胞壁酸连接的。当碱性多肽和肽聚糖发生作用之后，聚糖链 的连接键会被切断，被切断后细菌被裂解而死亡。碱性多肽可以使淋巴细胞、脾细胞增殖能 力增强，巨噬细胞的吞噬能力增强，从而使机体的免疫作用提高。
[0008] 基于其优异的生理功能，甘露聚糖肽在治疗恶性肿瘤、皮肤疾病、呼吸道感染及白 细胞减少症等临床应用领域也取得了显著的发展和进步，而且临床需求不断扩大，这也为 甘露聚糖肽的提取分离工艺提出了更高的要求，这就需要从各方面进行研究，包括方法创 新、育种技术和发酵工艺的改进等。
[0009] 目前，甘露聚糖肽制剂主要有口服液、片剂、小针剂。然而由于甘露聚糖肽的现有 剂型中主药含量较小，并且现有注射用甘露聚糖肽在临床使用时容易造成二次污染，易发 生输液反应，有时也会发生差错而产生医疗事故，所以存在对大剂量、并且能够避免二次污 染的甘露聚糖肽新剂型的需要。专利CN100413510C提供了一种甘露聚糖肽注射剂，它是 由甘露聚糖肽为活性成分，加上药学上可接受的注射用附加剂制备而成的注射剂，其中，每 lmg注射剂中含有毒素量应小于30EU，同时还提供了甘露聚糖肽注射剂的制备方法。专利 CN1429558A提供了一种甘露聚糖肽注射液，其中含有甘露聚糖肽，等渗物质，其余为水，其 中，所含甘露聚糖肽的浓度在注射液中为lmg/L~2000mg/L，并且每支或者每瓶中所装所述 注射液的体积为50~1000ml，含有的甘露聚糖肽的有效量为l~500mg，同时还提供了甘露聚 糖肽注射液的制备方法。
【发明内容】
[0010] 本发明所要解决的技术问题是，针对现有技术的不足，提供一种控制简单，提纯精 制效率高的甘露聚糖肽原料药的制备工艺及其产品应用。
[0011] 为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：甘露聚糖肽原料药的制备工 艺，包括以下步骤： 第一步，制备发酵产物：以a-溶血链球菌为生产菌种，经发酵、高温灭活、离心过滤、滤 液浓缩，得到含有甘露聚糖肽发酵产物的浓缩液； 第-步，提纯精制： A、 在第一步所得浓缩液中，加入体积量为浓缩液1~3倍的95%的乙醇，充分搅拌，降温， 保持温度彡l〇°C，静置18~22小时进行沉淀，离心，收集沉淀物； B、 加入体积量为沉淀物2~4倍量的纯化水，搅拌溶解，并升温至45~50°C，停止搅拌，静 置10~14小时，离心，弃去沉淀物，收集清液； C、 将清液加盐酸溶液调PH值至1. 5~1. 7,降温，保持温度为3~5°C，静置10~14小时，离 心，弃去沉淀物，收集清液； D、 将步骤C所得清液按照步骤A、B、C反复操作数次至中间检测合格为止，得到甘露聚 糖肽清液； E、加入体积量为步骤D所得清液1~3倍的95%的乙醇，充分搅拌，降温，保持温度 < 10°C，静置18~22小时进行沉淀，离心，收集沉淀物，即得甘露聚糖肽湿品； 第三步，真空干燥：将第二步所得甘露聚糖肽湿品进行真空干燥，即得甘露聚糖肽干 品； 第四步，粉碎：将第三步所得甘露聚糖肽干品加入粉碎机中进行粉碎，即得甘露聚糖肽 原料药。
[0012] 所述第一步的所述高温灭活为发酵结束后，发酵罐夹层通入蒸汽对发酵罐预热、 升温至100 ±5 °C，保温10分钟。
[0013] 所述第一步的所述滤液浓缩是对离心过滤所得滤液通过双效外循环蒸发器进行 浓缩，控制温度为80~90°C，表压力为0. 02Mpa~0. 04Mpa，真空度为-0. 02~-0. 08Mpa，浓缩至 比重为 1. 12~1. 14。
[0014] 所述第二步的C步骤中，所述盐酸溶液的质量百分含量为20%。
[0015] 所述第三步的所述真空干燥的温度为65~70°C，真空度为-0. 05~-0. 08Mpa，干燥 时间为2~3小时，控制水分的质量百分含量彡4. 8%。
[0016] 所述第二步的D步骤中，按照步骤A、B、C反复操作两次，得到甘露聚糖肽清液。
[0017] 所述甘露聚糖肽原料药用于治疗免疫功能低下，辅助治疗反复呼吸道感染、白细 胞减少症、再生障碍性贫血及肿瘤。
[0018] 所述甘露聚糖肽原料药用于制备甘露聚糖肽口服液。
[0019] 所述甘露聚糖肽口服液包括有效量的所述甘露聚糖肽原料药和药学上可接受的 辅助添加成分。
[0020] 所述甘露聚糖肽口服液，包括重量份的下述原料，甘露聚糖肽原料药1份、氯化钠 4~6份、纯化水1000份、碳酸氢钠适量。
[0021] 所述甘露聚糖肽口服液的制备工艺，包括以下步骤： (1) 配液： a、 量取纯化水置配制罐中，加入上述重量份的甘露聚糖肽原料药和氯化钠，开启搅拌 使其完全溶解，将溶液经板框过滤器过滤至贮罐； b、 经配制罐加纯化水至工艺配制量，开启卫生泵使药液在贮罐中循环30分钟； c、 取样检验，合格后经板框过滤器过滤至中转桶，传至灌封间； d、 若PH值不符合工艺要求，用5% (wt%)的碳酸氢钠溶液调节PH值至工艺要求，再开 启卫生泵使药液在贮罐循环30分钟，重复步骤c;所述PH值为5. 5-7. 5; (2) 灌封轧盖：每支装量10. 0~10. 5ml ; (3) 灭菌：控制温度为115°C，时间30分钟； (4) 灯检、包装：灯检合格后进行包装。
[0022] 优选的，所述步骤d中的PH值为6. 0-7. 0。
[0023] 所述碳酸氢钠的含量根据调节所述配液步骤的PH值所消耗的量进行控制，且最 大添加量不超过15g/kg甘露聚糖肽原料药。
[0024]本发明的有益效果如下： ①本发明甘露聚糖肽原料药的制备工艺，通过发酵产物的制备、提纯精制、真空干 燥及粉碎这些工艺步骤，制备出甘露聚糖肽原料药，所得原料药的产量高，重均分子量在 40000~90000之间，分子量分布宽度指数为