一种能够降解*的功能蛋白的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物工程技术与难降解有机污染物生物处理技术领域，特别涉及一种 能够降解窟啲功能蛋白。
【背景技术】
[0002] 多环芳煙（Polycyclic Aromatic Hydrocarbons，PAHs)是一类含有两个或两个以 上苯环的有毒有机污染物，具有强烈的致癌作用、致畸作用和致突变作用。PAHs能通过生物 累积及食物链的传递作用对生态环境和人体健康造成极大危害，已引起各国环境科学家的 高度重视。美国环保局早在80年代就已把16种未带分支的PAHs确定为环境中的优先污 染物，我国也把PAHs列入环境污染的黑名单中。
[0003] 目前对环境中多环芳烃的治理技术主要有物理法、化学法和生物法。物理处理技 术主要存在处理费用高与去除不彻底的缺点。在化学法中国内外有学者利用有机溶剂（如 乙醇、正己烷、二氯甲烷、三氯甲烷、丙酮）及表面活性剂等洗脱环境中的多环芳烃，但会存 在二次污染等问题。生物法具有操作简单、运行费用低、无二次污染等优点。一般来说，随 着多环芳烃苯环数量的增加，其降解速率降低。因此，低分子量的多环芳烃在环境中能较快 被降解，在环境中存在的时间较短，而高分子量的多环芳烃，例如苯并[a]芘、窟等则难于 降解，较长期存在于环境中。从降解微生物细胞中提取功能蛋白来强化降解已成为去除多 环芳烃污染的一种重要方法。功能蛋白在多环芳烃降解的应用中具有降解效率高、作用底 物浓度低及环境适应性强等优点，具有广阔的应用前景。但是，由于对多环芳烃降解微生物 缺乏深入的研究，国内外缺少高环多环芳烃功能蛋白方面的研究报道。
【发明内容】
[0004] 本发明提供一种能够降解[窟的功能蛋白。所述能够催化降解.窟的功能蛋白由人 苍白杆菌Ochrobactrum anthropi DW1的菌液经过提取与纯化得到的。该功能蛋白在进行 催化降解窟时，适宜pH值为6. 0~8. 0,最适宜pH值为7. 0,当pH值小于4及大于10时容 易失活变性，适宜反应温度为30~45°C，最适宜反应温度为35°C，当温度高于50°C易于失 活变性，浓度为lmm0l/L的Cu 2+、Ni2+、Hg2+离子对功能蛋白的活性有较强抑制作用。
[0005] 分离能够催化降解:窟的功能蛋白所用的菌株人苍白杆菌Ochrobactrum anthropi DW1在2013年12月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，该中 心位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，菌种保藏号为CGMCC N0. 8621。从人苍白杆菌Ochrobactrum anthropi DW1中分离能够催化降解窟的功能蛋白 具体方案为：
[0006] ①向加入198ml诱导培养基、2. 0ml微量金属液和0. 2ml维生素c溶液的培 养瓶内接种保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的菌株人苍白杆菌 Ochrobactrum anthropi DW1;然后用透气膜密封瓶口，将培养瓶在培养温度为25~28°C、 转速为lOOr/min的振荡器中培养40d后即可得到扩增培养后的菌液；
[0007] ②将步骤①中的菌液进行超声波破碎15min;破碎后的菌液在8000r/min条件下 离心15min，分离出菌体和上清液；
[0008] ③向由步骤②分离出的菌体中加入30ml去离子水，继续进行超声波破碎15min， 在8000r/min条件下离心15min，分离出菌体和上清液；
[0009] ④向由步骤③分离出的菌体中加入30ml去离子水，继续进行超声波破碎15min， 在8000r/min条件下离心15min，分离出菌体和上清液；
[0010] ⑤合并由步骤②、③和④所收集的上清液，即可得到功能蛋白粗提液；
[0011] ⑥向由步骤⑤得到的功能蛋白粗提液中加入碾细的（NH4)2S0 4固体至65~70%饱 和度，在转速为l〇〇r/min的振荡器中振荡1~2h，然后在8000r/min条件下离心15min，分 离出沉淀；
[0012] ⑦将由步骤⑥得到的沉淀溶于5ml pH值为7. 0~7. 2的0? 05mol/L三羟基甲基 氨基甲烷-HC1缓冲液并装入透析袋中，将透析袋在pH值为7. 0~7. 2的0. 05mol/L三羟 基甲基氨基甲烧-HC1缓冲液中透析24h ;将透析后的样品在8000r/min条件下离心15min， 分离出上清液；
[0013] ⑧将由步骤⑦得到的上清液上到已用pH值为7. 0~7. 2的0. 05mol/L三羟基甲 基氨基甲烷-HC1缓冲液平衡的Q S印harose Fast Flow阴离子交换柱上过滤，采用pH值 为7. 0~7. 2内含0? 25mol/L氯化钠的0? 05mol/L三羟基甲基氨基甲烷-HC1缓冲液线形 洗脱梯度洗脱结合的功能蛋白，洗脱速度为20ml/h;运用容积为10ml的试管收集洗脱液， 其中每支试管收集洗脱液5ml;用紫外分光光度计在吸收波长为280nm处检测洗脱液，收集 吸光度大于〇. 01的洗脱液；测定功能蛋白的活性，选择活性部分备用。
[0014] 所述步骤①中诱导培养基的组成为：NaN03:2. 5g/L，NH4C1 :1. 5g ? L_\ KH2P04: 1. 5g ? I71，MgCl2:0. 2g ? L' CaCl2 ? 2H20 :0? 15g ? I71，窟：0? Olg ? L'
[0015] 所述步骤①中微量金属液的组成为：CoCl2 ? 6H20 :35mg ? L-1，CuCl2:0. 25mg ? L-1， H3B〇3：6. Omg *L_1,MnCl2 *4H20 ：30mg ? L_1,Na2Mo04 ? 2H20 ：3. Omg *2H20 ：2. 5mg *L_1, ZnCl2:2. 5mg ? L、
[0016] 所述步骤步骤②、③和④中超声波破碎的条件为：电流35%、脉冲9. Os、处理时间 15min〇
[0017] 本发明得到的功能蛋白可以有效催化降解窟，对于多环芳烃窟污染土壤及水体有 应用潜力。
【具体实施方式】
[0018] 下面结合实例进一步说明本发明。
[0019] 材料：（1)保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的菌株人苍白 杆菌Ochrobactrum anthropi DW1，菌种保藏号为CGMCC N0.8621 ;
[0020](2)窟（纯度> 99%，Sigma Aldrich);
[0021](3) NaCl、（NH4) 2S04:分析纯；
[0022] (4)pH值为7. 0~7. 2的0? 05mol/L三羟基甲基氨基甲烷-HC1缓冲液，pH值为 3. 0、4. 0、5. 0、6. 0、6. 5、7. 0、7. 5、8. 0、9. 0、10. 0 的磷酸缓冲液；
[0023] (5)诱导培养基1L，其组成及各组分的浓度为：NaN03:2. Og/L，NH4C1 :1. Og ? L-1， KH2P04:1. Og ? L-1，MgCl2:0. lg ? L' CaCl2 ? 2H20 :0? 05g ? L'窟：0? Olg ? I71;
[0024] (6)微量金属液1L，其组成及各组分的浓度为：C〇Cl2 ? 6H20 :35mg ? L_S CuCl2: 0? 25mg ?L_1，H3B03:6. Omg ?L'MnCh *4H20 :30mg ?L_1，Na2Mo04 *2H20 :3. Omg ?L_1，NiCl2 *2H20 : 2. 5mg ? L \ ZnCl2:2. 5mg ? L、
[0025] 功能蛋白活性的检测方法：以功能蛋白与窟反应消耗的窟:量来确定功能蛋白的 活性。取0. 2mL功能蛋白和4. 8mL含有窟浓度为0. 2 y g/L pH值为7. 5的磷酸缓冲液混 合，在温度为35°C条件下反应24h，加入0. 3mL浓度为2. Omol/L的HC1终止功能蛋白反应， 测定降解结束后窟浓度的变化。
[0026] 实施例
[0027] 向已加入198ml诱导培养基、2. 0ml微量金属液和0. 2ml维生素c溶液的培 养瓶内接种保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的菌株人苍白杆菌 Ochrobactrum anthropi DW1，然后将培养瓶在培养温度为25~28°C、转速