为100r/min的 振荡器中培养40d，得到扩增培养后的菌液。
[0028] 将得到的菌液超声波破碎15min后在8000r/min条件下离心15min，分离出菌体 和上清液。向分离出的菌体中加入30ml去离子水，继续进行超声波破碎15min，在8000r/ min条件下离心15min，分离出菌体和上清液，重复2次。合并3次所收集的上清液，得到功 能蛋白粗提液。
[0029] 向功能蛋白粗提液中加入碾细的（NH4)2S04固体至65%饱和度，在转速为100r/ min的振荡器中振荡1~2h，然后在8000r/min条件下离心15min，分离出沉淀。然后将沉 淀溶于少量pH值为7.0~7.2的0. 05mol/L三羟基甲基氨基甲烷-HC1缓冲液并装入透析 袋中，将透析袋在pH值为7.0~7.2的0. 05mol/L三羟基甲基氨基甲烷-HC1缓冲液中透 析24h。将透析后的样品在8000r/min条件下离心15min，分离出上清液。将上清液上到已 用pH值为7.0~7.2的0? 05mol/L三羟基甲基氨基甲烷-HC1缓冲液平衡的QS印harose Fast Flow阴离子交换柱上过滤，采用pH值为7.0~7.2内含0? 25mol/L氯化钠的0? 05mol/ L三羟基甲基氨基甲烷-HC1缓冲液线形洗脱梯度洗脱结合的功能蛋白，洗脱速度为20ml/ h。运用容积为10ml的试管收集洗脱液，其中每支试管收集洗脱液5ml。用紫外分光光度计 在吸收波长为280nm处检测洗脱液，收集吸光度大于0.01的洗脱液。
[0030] 分别用 pH 值为 3. 0、4. 0、5. 0、6. 0、6. 5、7. 0、7. 5、8. 0、9. 0、10. 0 的含有窟浓度为 〇. 2 y g/L磷酸缓冲液与0. 2mL的功能蛋白配成总体积为5. OmL的反应体系，在30°C条件下 反应24小时，加入0. 3mL浓度为2. 0m〇l/L的HC1终止功能蛋白反应。同时分别设定不加 功能蛋白的控制试验，取降解率的最大值为100计算各处理的相对功能蛋白活力，以确定 功能蛋白反应的最适宜pH值。结果表明，功能蛋白在pH值为3. 0~10. 0之间对窟均有不 同程度的降解，其适宜的pH值为6. 0~8. 0,最适宜pH值为7. 0,当pH值小于4及大于10 时容易失活变性，在最适宜pH值条件下反应24小时对窟的降解率为82. 9%。
[0031] 在pH值为7. 0条件下，将含有窟浓度为0. 2 y g/L磷酸缓冲液与0. 2mL的功能 蛋白配成体积为5. OmL的反应体系，分别在10°C、20°C、25°C、30°C、35°C、40°C、45°C、50°C 条件下反应24小时，然后加入0. 3mL浓度为2.0mol/L的HC1终止功能蛋白反应。同时分 别设定不加功能蛋白的控制试验，取降解率的最大值为100计算各处理的相对功能蛋白活 力，以确定功能蛋白反应的最适宜温度。结果表明，功能蛋白在温度为10~50°C之间对窟 均有不同程度的降解，其适宜的温度为30~45°C，最适宜温度为35°C，当温度高于50°C易 于失活变性，在最适宜温度条件下反应24小时对窟的降解率为88. 7%。
[0032]分别向8份pH值为7. 0含有窟浓度为0. g/L磷酸缓冲液中加入Cu2+、Zn2+、Fe 2+、 口132+、(：〇2+、附2+、]\% 2+、取2+，使离子的浓度为11111]1〇1/1，然后加入0.21111的功能蛋白配成总体积 为5. OmL的反应体系，在30°C条件下反应24小时，加入0. 3mL浓度为2. Omol/L的HC1终止 功能蛋白反应。同时分别设定不加功能蛋白和不加金属离子的控制试验，取降解率的最大 值为1〇〇计算各处理的相对功能蛋白活力，以确定各离子对功能蛋白活性的影响。结果表 明，浓度为lmm〇l/L的Cu 2+、Ni2+、Hg2+离子对功能蛋白活性有较强的抑制作用。
【主权项】
I. 一种能够降解窟的功能蛋白，其特征在于，该功能蛋白由人苍白杆菌Ochrobactrum anthropi DWl的菌液经过提取与纯化得到的，人苍白杆菌Ochrobactrum anthropi DWl的 菌种保藏号为CGMCC NO. 8621，其中，从人苍白杆菌Ochrobactrum anthropi DWl中分离能 够降解窟的功能蛋白具体方案为： ① 向加入198ml诱导培养基、2. Oml微量金属液和0. 2ml维生素 c溶液的培养瓶内接种 保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的菌株人苍白杆菌Ochrobactrum anthropi DWl ;然后用透气膜密封瓶口，将培养瓶在培养温度为25~28°C、转速为IOOr/ min的振荡器中培养40d后即可得到扩增培养后的菌液； ② 将步骤①中的菌液进行超声波破碎15min ;破碎后的菌液在8000r/min条件下离心 15min，分离出菌体和上清液； ③ 向由步骤②分离出的菌体中加入30ml去离子水，继续进行超声波破碎15min，在 8000r/min条件下离心15min，分离出菌体和上清液； ④ 向由步骤③分离出的菌体中加入30ml去离子水，继续进行超声波破碎15min，在 8000r/min条件下离心15min，分离出菌体和上清液； ⑤ 合并由步骤②、③和④所收集的上清液，即可得到功能蛋白粗提液； ⑥ 向由步骤⑤得到的功能蛋白粗提液中加入碾细的（NH4)2SO4固体至65~70%饱和 度，在转速为l〇〇r/min的振荡器中振荡1~2h，然后在8000r/min条件下离心15min，分离 出沉淀； ⑦ 将由步骤⑥得到的沉淀溶于5ml pH值为7. 0~7. 2的0. 05mol/L三羟基甲基氨基 甲烷-HCl缓冲液并装入透析袋中，将透析袋在pH值为7. 0~7. 2的0. 05mol/L三羟基甲 基氨基甲烷-HCl缓冲液中透析24h ;将透析后的样品在8000r/min条件下离心15min，分离 出上清液； ⑧ 将由步骤⑦得到的上清液上到已用pH值为7. 0~7. 2的0. 05mol/L三羟基甲基氨基 甲烷-HCl缓冲液平衡的Q S印harose Fast Flow阴离子交换柱上过滤，采用pH值为7.0~ 7. 2内含0. 25mol/L氯化钠的0. 05mol/L三羟基甲基氨基甲烷-HCl缓冲液线形洗脱梯度洗 脱结合的功能蛋白，洗脱速度为20ml/h ;运用容积为IOml的试管收集洗脱液，其中每支试 管收集洗脱液5ml ;用紫外分光光度计在吸收波长为280nm处检测洗脱液，收集吸光度大于 〇. 01的洗脱液；测定功能蛋白的活性，选择活性部分备用； 所述步骤①中诱导培养基的组成为：NaN03:2. 5g/L，NH4Cl :1. 5g ·ΙΛKH2PO4=L 5g吨4， MgCl2:0. 2g ·厂1，CaCl2 · 2H20 :0· 15g · Γ1，茚并[l，2,3-cd]芘：0· Olg · ΙΛ 所述步骤①中微量金属液的组成为=CoCl2 · 6Η20 :35mg · Γ1，CuCl2:0. 25mg · L ' H3BO3: 6. Omg · Γ1，MnCl2 · 4H20 :30mg · I/1，Na2MoO4 · 2H20 :3. Omg · Γ1，NiCl2 · 2H20 :2. 5mg · Γ1， ZnCl2:2. 5mg · L、
【专利摘要】本发明提供一种能够降解的功能蛋白。所述能够催化降解的功能蛋白由人苍白杆菌Ochrobactrum anthropi DW1的菌液经过提取与纯化得到的，该人苍白杆菌Ochrobactrum anthropi DW1的菌种保藏号为CGMCC NO.8621。该功能蛋白在进行催化降解时，适宜pH值为6.0～8.0，最适宜pH值为7.0，当pH值小于4及大于10时容易失活变性，适宜反应温度为30～45℃，最适宜反应温度为35℃，当温度高于50℃易于失活变性，浓度为1mmol/L的Cu2+、Ni2+、Hg2+离子对功能蛋白的活性有较强抑制作用。本发明提供的功能蛋白可以有效催化降解，对于多环芳烃污染土壤及水体有应用潜力。CGMCC No.862120131220
【IPC分类】C12R1-01, C12N9-00
【公开号】CN104673763
【申请号】CN201510097222
【发明人】朱宜, 袁静, 谢恩, 郑蕾, 丁爱中, 豆俊峰
【申请人】北京师范大学
【公开日】2015年6月3日
【申请日】2015年3月5日