一种杂交瘤细胞株、及其分泌单克隆抗体和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种杂交瘤细胞株、其所分泌的单克隆抗体、使用分泌的单克隆抗体 制备的药物组合物、试剂盒及应用，属于生物医药领域。
【背景技术】
[0002] 猪流行性腹泻（porcineepidemicdiarrhea,PED)是由猪流行性腹泻病毒 (porcineepidemicdiarrheavirus,PEDV)引起的急性、接触性、高度传染性消化道疾病， 主要症状为呕吐、水样腹泻和脱水，感染7日龄以内仔猪死亡率高达80%-100%。对我国 养猪业造成巨大的损失。自2010年以来，我国秋冬季节大面积爆发腹泻疾病，与此同时，韩 国、日本、台湾、美国等地也大范围爆发此病。分子生物学研宄表明，猪流行性腹泻病毒发生 了变异，已有的疫苗株对流行毒株的感染起不到很好的保护作用。
[0003]目前，国内外已有的商品化疫苗均为经典的疫苗株，对控制本病虽有一定的效 果，但仍不能提供给仔猪很好的被动保护。同时，仔猪获得母源抗体的水平不均一，易引 起部分仔猪再次发病并使病原迅速传播。虽已有用于预防或治疗猪流行性腹泻病毒的 卵黄抗体，但卵黄抗体是高蛋白质，不仅成本较高，在生产过程中还易发生细菌感染而不 易规模化生产（张家峥，施萍，牛桂玲.使用高免卵黄抗体液利弊及前景.中国家禽， 2003, 25(23) :45)。基于此，亟需一种新的途径解决现有疫苗、母源抗体不足时所引发的猪 流行性腹泻病毒感染，以及现有疫苗单一的预防作用。
【发明内容】
[0004] 为了解决现有技术的不足，本发明提供了一种杂交瘤细胞株、其所产生的抗猪流 行性腹泻病毒单克隆抗体及应用，该单克隆抗体可以预防和/或治疗猪流行性腹泻病毒所 引发的感染，还可用于检测猪流行性腹泻病毒。
[0005] 本发明的第一方面在于提供小鼠骨髓杂交瘤细胞8A3A10株，所述杂交瘤细胞 8A3A10株保藏号为CCTCCNo.C2014197,保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国 武汉?武汉大学，保藏时间为2014年11月3日。
[0006] 本发明的小鼠骨髓杂交瘤细胞8A3A10株由猪流行性腹泻病毒HN1301株抗原免疫 小鼠后，取其脾细胞，与SP2/0骨髓瘤细胞融合，经筛选制得。其所产生的单克隆抗体的中 和抗体效价大于1:512,具有良好的中和活性；单克隆抗体的相对亲和力常数为1:5120,与 抗原的抗原决定簇的结合强度非常高。
[0007] 本发明的第二方面在于提供一种单克隆抗体，所述单克隆抗体由所述杂交瘤细胞 8A3A10株分泌产生。
[0008] 所述单克隆抗体能有效抵抗猪流行性腹泻病毒，所述单克隆抗体是由所述杂交瘤 细胞8A3A10株分泌产生。所述单克隆抗体的中和抗体效价大于1:512,也就是说，所述单克 隆抗体具有良好的中和活性，可抑制猪流行性腹泻病毒重复感染靶细胞；所述单克隆抗体 的相对亲和力常数为1:5120,也就是说，其与抗原的抗原决定簇的结合强度非常高，优于现 有技术中的抗猪流行性腹泻病毒单克隆抗体的结合强度。
[0009] 术语"单克隆抗体"是指获自基本上同源的抗体群的抗体，即组成该群体的抗体个 体都相同，除了可能存在少量可能的自发突变。因此，修饰语"单克隆"是指该抗体的性质 不是离散抗体的混合物。优选地，所述单克隆抗体包括单价的或是单链抗体、双链抗体、嵌 合抗体、人源化抗体以及上述抗体的衍生物、功能等同物和同源物，也包括抗体片段和含有 抗原结合结构域的任何多肽。
[0010] 术语"抗体"应该解释为涵盖具有所需特异性的结合结构域的任意特异性结合因 子。因而，这个术语涵盖了与之同源的抗体片段、衍生物、人源化抗体以及抗体的功能等同 物和同源物，也包括含有抗原结合结构域的任何多肽，无论是天然的还是合成产生的。抗体 的实例是免疫球蛋白亚型（如IgG、IgE、IgM、IgD和IgA)及其亚型亚类；也可以是包含抗 原结合结构域的片段如Fab、scFv、Fv、dAb、Fd;和双链抗体（diabodies)。融合至另一多肽 的、包含抗原结合结构域的嵌合体分子或者等同物也包括在其中。嵌合抗体的克隆与表达 在EP. A. 0120694和EP. A. 0125023中描述。
[0011] 术语"抗体"可以通过许多方式修饰，可用DNA重组技术来产生保留原来抗体特异 性的其它抗体或嵌合分子。这种技术可以包括将编码抗体的免疫球蛋白可变区或互补性决 定区（CDRs)的DNA引入不同免疫球蛋白的恒定区或恒定区加框架区。参见，EP.A. 184187， GB2188638A或EP.A. 239400。还可以对杂交瘤细胞或产生抗体的其它细胞进行遗传突变或 其它改变，这可以改变或者不改变所产生抗体的结合特异性。
[0012] 用于本发明的"单克隆抗体"可用杂交瘤方法制得，因为编码本发明鼠源化抗体的 DNA序列可用本领域技术人员熟知的常规手段，如根据氨基酸序列人工合成或用PCR法扩 增得到，因而也可用重组DNA方法，可用本领域熟知的各种方法将该序列连入合适的表达 载体中。最后，在适合本发明抗体表达的条件下，培养转化所得的宿主细胞，然后本领域技 术人员应用熟知的常规分离纯化手段纯化得到本发明的单克隆抗体。
[0013] 术语"中和抗体"在本文以最广义使用，指的是抑制猪流行性腹泻病毒重复感染 靶细胞的任何抗体，而不管实现中和的机制。因而，举例来说，可通过抑制病毒附着或粘附 到细胞表面来实现中和，例如通过设计抗体，所述抗体直接结合到，或者接近于，负责病毒 附着或粘附的位点，还可以通过定向到病毒体（Virion)表面的抗体来实现中和，其导致 病毒体的聚集，可通过抑制病毒附着到靶细胞以后病毒和细胞膜融合，通过抑制胞吞作用 (endocytosis)抑制来自受感染的子代病毒等，进一步发生中和。本发明的中和抗体不受限 于实现中和的机制。
[0014] 本发明的第三方面在于提供一种药物组合物，所述药物组合物包括有效量的所述 杂交瘤细胞8A3A10株分泌产生的单克隆抗体或其活性片段或保守性变异体或上述的组 合，以及药学上可接受的载体。
[0015] 术语"单克隆抗体或其活性片段或保守性变异体"，又可称为"单克隆抗体之保守 性变异体或活性片段"，所述保守性变异体或活性片段的氨基酸序列中与本发明所述单克 隆抗体之氨基酸序列相比存在一个或多个保守性氨基酸替换、添加或删除而仍能保持与猪 流行性腹泻病毒特异性结合。术语"保守性变异体"是指基本上保留了其母本的特性，如基 本的免疫学生物特性、结构特性、调节特性或生化特性的变异体。一般地，多肽的保守性变 异体之氨基酸序列不同于母本多肽。但是差异是有限的，以使与母本多肽之序列与保守性 变异体总体上非常相似，并且在许多区域是相同的。保守性变异体和母本多肽氨基酸序列 上的差异可以是例如：一个或多个氨基酸残基及其任一组合的替换、添加和删除。替换或插 入的氨基酸残基可由遗传密码编码，也可不由遗传密码编码。多肽的保守性变异体可以自 然产生，或者它可以是非自然产生的变异体。多肽之非自然产生的保守性变异体可通过诱 变技术或直接合成而产生。
[0016] 术语"有效量"当理解为"预防有效量"时，是指能够在接种的个体中足以引发免 疫保护反应的量。本领域技术人员知晓，所述"预防有效量"随免疫接种的方式、时机、给