行性腹泻病毒引起的腹泻或减轻发病程度；
[0047] 4.弥补现有疫苗单一的预防作用，还可以用于紧急治疗猪流行性腹泻病毒引起 的腹泻病；
[0048] 5.可以用于开发关于猪流行性腹泻病毒的诊断试剂或用于表位鉴定研宄，具有一 定的学术价值和意义。
[0049] 6.该单克隆抗体具有中和病毒的活性，能够用于相关联苗的鉴别检验。
【附图说明】
[0050] 图1示出方阵滴定法中用于确定抗原和酶标二抗最佳稀释度的饱和曲线。
【具体实施方式】
[0051] 下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述更 为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人 员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进 行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
[0052] 本发明实施例中所用的抗原为猪流行性腹泻病毒HN1301株，该毒株保藏号为 CCTCCNO.V201341，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉市?武汉大 学，保藏日期为2013年9月16日。
[0053] 本实施例中所用的PBS为pH值7. 4的磷酸盐缓冲液，其1L体积配方为：NaCl 8. 0g、KC1 0. 2g、Na2HP04 ? 12H20 2. 9g、KH2P040. 24g，但该实施方式无论在任何情况下均不 构成对本发明的限定。
[0054] 本实施例所用的DMEM培养液，50X的HAT/HT选择培养液为将HAT/HT选择培养基 溶于10mLDMEM培养液中；DMEM完全培养液为40mLDMEM、10mLHyclone血清；DMEM选择培 养液为 39mLDMEM、10mLHyclone、lmL50XHAT/HT选择培养液；细胞冻存液为 70mLDMEM、 20mLHyclone、10mLDMS0,但该实施方式无论在任何情况下均不构成对本发明的限定。
[0055] 为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这 些实施例仅用于本发明而不用于限制本发明的范围。本发明所述的实验方法，若无特殊说 明，均为常规方法；所述的生物材料，若无特殊说明，均可从商业途径获得。
[0056] 实施例1杂交瘤细胞株的获得
[0057] 1. 1PEDV病毒的繁殖与纯化
[0058] 1.1.1抗原的制备
[0059]将长成良好单层的Vero细胞（Vero细胞来源于上海生化所），用PBS清洗2-3次， 接M0I= 0. 001的接毒剂量接种PEDVHN1301株，接种时病毒液和维持液的总量为lmL，置 于37°C孵育60分钟，期间每隔20分钟轻轻混匀一次，吸附后弃掉瓶内液体，加入新鲜维持 液5mL，置于37°C0)2培养箱中，待到细胞病变达到90%时收获病毒液，冻存于-20°C备用。
[0060] 1.1. 2抗原的纯化
[0061] 取病毒液200mL加入20mL的TritonX-100,室温震荡10min，以高速冷冻离心机 5000rpm离心30min，取离心上清液于超速冷冻离心机40000rpm，离心2h，沉淀充分溶解于 适量0. 01m〇L/LpH值7. 4的PBS中，即为PEDV抗原，测定抗原效价为107.5TCID5Q/mL，分装 冷冻保存在-20°C。
[0062] 1.2小鼠免疫
[0063] 病毒液和佐剂按1:1 (V/V)的比例混合，乳化。免疫6-8周龄的BALB/c雌性小鼠， 采用的免疫方式为背部皮下多点注射，免疫剂量为〇.2mL/只。首免用弗氏完全佐剂，之后 两次加强免疫用弗氏不完全佐剂。第三次免疫后可适时检测小鼠血清的IFA抗体效价，当 血清IFA效价高于1:800时可以用于第四次免疫即冲击免疫，冲击免疫时尾静脉注射纯化 后的抗原。在细胞融合前三天选取血清IFA效价水平最高的小鼠进行冲击免疫，三天后取 其脾细胞，与SP2/0骨髓瘤细胞融合。此小鼠的血液可制成血清，作为阳性血清使用。
[0064] 表1小鼠的免疫程序
【主权项】
1. 小鼠骨髓杂交瘤细胞8A3A10株，所述杂交瘤细胞8A3A10株保藏号为CCTCCNo: C2014197,保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉?武汉大学，保藏时间为 2014年11月3日。
2. -种单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体由权利要求1所述的杂交瘤细胞 8A3A10株分泌产生。
3. -种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括有效量的权利要求2所述的单 克隆抗体或其活性片段或保守性变异体或上述的组合，以及药学上可接受的载体。
4. 一种制备权利要求3所述的药物组合物的方法，所述方法包括： (1) 使用权利要求1所述的杂交瘤细胞8A3A10株分泌表达单克隆抗体；以及 (2) 将所述步骤（1)中表达的单克隆抗体加入药学上可接受的载体。
5. -种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括有效量的权利要求2所述的单克隆抗体 或其活性片段或保守性变异体或上述的组合，所述的单克隆抗体或其活性片段或保守性变 异体或上述的组合用于和猪流行性腹泻病毒进行抗原抗体反应。
6. 根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括对所述的单克隆抗 体或其活性片段或保守性变异体或上述的组合和猪流行性腹泻病毒的抗原抗体反应进行 检测的检测试剂、阴性对照、阳性对照。
7. 根据权利要求2所述的单克隆抗体在制备预防和治疗猪流行性腹泻的药物中的应 用。
8. 根据权利要求3所述的药物组合物在制备预防和治疗猪流行性腹泻的药物中的应 用。
9. 根据权利要求2所述的单克隆抗体在鉴别检验含猪流行性腹泻病毒抗原和其他抗 原的疫苗组合物中的应用；优选地，所述其他抗原包括猪传染性胃肠炎病毒抗原、猪轮状病 毒抗原、猪圆环病毒抗原、猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原、副猪嗜血杆菌抗原、猪细小病毒 抗原、大叶性肺炎放线杆菌抗原、大肠杆菌抗原、猪萎缩性鼻炎抗原、猪伪狂犬病病毒抗原、 猪霍乱病抗原、猪流感病毒抗原中的一种或多种。
10. 根据权利要求5或6所述的试剂盒在用于非诊断目的的猪流行性腹泻病毒检测分 析中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种杂交瘤细胞株及其所产生的抗猪流行性腹泻病毒单克隆抗体。本发明提供的抗猪流行性腹泻病毒单克隆抗体，对猪流行性腹泻病毒具有预防和/或治疗作用，解决了现有疫苗、母源抗体不足时所引发的仔猪流行性腹泻病毒感染，并且弥补现有疫苗单一的预防作用；还可用于开发猪流行性腹泻病毒的诊断试剂产品。CCTCC No： C201419720141103 CCTCC NO：V20134120130916
【IPC分类】C07K16-10, G01N33-577, C12N5-20, A61K39-42, A61P31-14, G01N33-569
【公开号】CN104694480
【申请号】CN201510132778
【发明人】田克恭, 王延辉, 张云静
【申请人】洛阳普莱柯万泰生物技术有限公司
【公开日】2015年6月10日
【申请日】2015年3月25日