用于检测fmdv、vsv、svdv、pprv和btv的基因芯片及其检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物芯片领域。具体而言，本发明涉及口蹄疫病毒、水疱性口炎病毒、 猪水疱病病毒、小反合兽疫病毒和蓝舌病病毒的基因芯片及其检测方法。
【背景技术】
[0002] 口蹄疫（Foot-and-mouth disease，FMD)、水疱性口炎（Vesicular stomatitis， VS)、猪水疱病（Swine vesicular disease，SVD)、小反合兽疫（peste des petits ruminants，PPR)和蓝舌病（Bluetongue disease, BT)分别由口蹄疫病毒（Foot-and-mouth disease virus，FMDV)、水疱性口 炎病毒（Vesicular stomatitis virus，VSV)、猪水疱 病病毒（Swine vesicular disease virus，SVDV)、小反合兽疫病毒（peste des petits ruminants virus，PPRV)和蓝舌病病毒（Bluetongue virus, BTV)引起的急性、烈性病毒性 传染病。FMDV、VSV、SVDV、PPRV和BTV五种病毒广泛流行于世界各地，宿主范围广，发病率 高，均为妨碍畜牧业发展的重要疫病。世界动物卫生组织（0IE)将其均列为法定报告疫病， 我国也将其列为一类传染病。口蹄疫、水疱性口炎和猪水疱病均可感染猪，且以蹄部、口腔、 乳房等出现疱瘆为主要临床症状。蓝舌病和小反刍兽疫主要感染山羊、绵羊、牛等，患病动 物的乳房和蹄部也出现病变。五种病毒感染易感动物可出现相似的临床症状，因此不能通 过临床症状进行区分，必须进行病原学鉴别诊断。因而在动物及其副产品的进出口检疫时， 对相应病毒的检测有着重要的意义。
[0003] 近年来，随着全球一体化的加快，不断扩大的国际贸易为动物疫病的扩散增加了 机会。传统的病原分离鉴定和血清学方法，耗时长，需要专业的操作人员，已不能完全满 足进口动物疫病的快速、准确、高通量检测要求。随着分子生物学的发展，聚合酶链式反应 (PCR)广泛应用于动物疫病的检测，但目前缺乏可区分几种病毒的PCR方法。此外，FMDV、 VSV、SVDV、PPRV和BTV五种病毒均为RNA病毒，RNA易降解、不稳定性一定程度上增加病原 诊断的难度。基因芯片（Gene chip)是由DNA或寡核苷酸探针密集排列在经过共价结合醛 基、氨基或多聚赖氨酸的固相支持物所形成的探针阵列，在适当的温度、湿度条件下，利用 特异性探针与经过适当方式标记的待检样品DNA通过碱基互补配对杂交，然后通过相应的 检测设备，检测杂交信号的位置和强弱，判断样品种类，完成疾病检测和基础研宄等方面 的工作。该方法具有高通量、平行化、微量化、自动化、低成本的优点。结合基因芯片的优势， 建立一种快速检测鉴别口蹄疫病毒、水疱性口炎病毒、猪水疱病病毒、蓝舌病病毒和小反刍 兽疫病病毒的基因芯片技术，可满足进出口动物疫病的快速、准确诊断，有效防止动物疫病 通过国际贸易扩散传播。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是建立一种灵敏度高、特异性强、节时省力并且易于观察结果的微 阵列芯片检测口蹄疫病毒、水疱性口炎病毒、猪水疱病病毒、小反刍兽疫病毒和蓝舌病病毒 的基因芯片。
[0005] 为了实现上述目的本发明采用如下技术方案：用于口蹄疫病毒、水疱性口炎病毒、 猪水疱病病毒、小反刍兽疫病毒和蓝舌病病毒的基因芯片检测装置，包括：PCR反应混合液 管、Taq聚合酶、PCR阳性对照、PCR阴性对照、ddH 20、检测芯片、芯片探针的点样分布、口蹄 疫病毒A型一条检测探针的核苷酸序列、口蹄疫病毒亚洲I型一条检测探针的核苷酸序列、 口蹄疫病毒〇型一条检测探针的核苷酸序列、口蹄疫病毒通用型一条检测探针的核苷酸序 列、水疱性口炎病毒一条检测探针的核苷酸序列、猪水疱病病毒一条检测探针的核苷酸序 列、蓝舌病病毒一条检测探针的核苷酸序列、小反刍兽疫病毒一条检测探针的核苷酸序列、 芯片盖片、杂交液、杂交阳性对照、杂交盒。
[0006] 采用基因芯片微量点样技术，将待测样品探针与各种质控探针固定在经过化学修 饰的基片上，形成的微阵列。微阵列包括质控探针区和待测样品探针区，其中所述质控探针 区内设置下述分区：
[0007] 点样位置质控分区P1，包含至少一个点样位置质控探针：SEQ ID NO. 9 ;
[0008] 杂交阳性质控分区P2,包含至少一个杂交阳性质控探针：SEQ ID NO. 10 ;
[0009] 杂交阴性质控分区N，包含点样缓冲液；
[0010] 所述待测样品探针区内设置下述包括至少一个待测样品探针的分区：
[0011] 口蹄疫病毒A型探针分区，
[0012] 口蹄疫病毒亚洲I型探针分区，
[0013] 口蹄疫病毒通用型探针分区，
[0014] 口蹄疫病毒0型探针分区，
[0015] 水疱性口炎病毒探针分区，
[0016] 猪水疱病病毒探针分区，
[0017] 蓝舌病病毒探针分区，
[0018] 小反刍兽疫病毒探针分区；
[0019] 各个探针序列如下：
[0020] 口蹄疫病毒A型探针：SEQ ID NO. 1 ;
[0021] 口蹄疫病毒亚洲I型探针：SEQ ID NO. 2 ;
[0022] 口蹄疫病毒通用型探针：SEQ ID NO. 3
[0023] 口蹄疫病毒0型探针：SEQ ID NO. 4 ;
[0024] 水疱性口炎病毒探针：SEQ ID NO. 5 ;
[0025] 猪水疱病病毒探针：SEQ ID NO. 6 ;
[0026] 蓝舌病病毒探针：SEQ ID NO. 7 ;
[0027] 小反刍兽疫病毒探针：SEQ ID NO. 8。
[0028] 利用上述基因芯片检测口蹄疫病毒、水疱性口炎病毒、猪水疱病病毒、小反刍兽疫 病毒和蓝舌病病毒的检测方法，具体步骤如下：
[0029] (1)待测样品制备：按照商品化RNA提取试剂盒使用说明书提取待检组织或病毒 的细胞增殖液的全基因组，进行反转录制备待测样品cDNA;
[0030] (2)?0?扩增：25 1^?0?反应液包含：1^&9酶12.5 1^、引物組17.8 1^、待测样 品DNA 3 y L、无核酸酶灭菌水1. 7 y L;
[0031] 其中，所述引物Mix含有：
[0032] 20ymol/L 口蹄疫A型病毒特异上游引物SEQ ID NO. 11 0. 2yL，
[0033] 20ymol/L 口蹄疫A型病毒特异下游引物SEQ ID NO. 12 0. 2yL，
[0034] 20ymol/L 口蹄疫亚洲I型病毒特异上游引物SEQ ID NO. 13 0.2yL，
[0035] 20 y mol/L 口蹄疫亚洲I型病毒特异下游引物SEQ ID NO. 14 0. 2 y L，
[0036] 20 ymol/L 口蹄疫0型病毒特异上游引物SEQ ID NO. 15 0? 2 y L，
[0037] 20 ymol/L 口蹄疫0型病毒特异上游引物SEQ ID NO. 16 0. 2 y L，
[0038] 20ymol/L水疱性口炎病毒特异上游引物SEQ ID NO. 17 0. 2yL,
[0039] 20ymol/L水疱性口炎病毒特异下游引物SEQ ID NO. 18 0.2yL,
[0040] 20 ymol/L猪水疱病病毒特异上游引物SEQ ID NO. 19 0? 2 y L,
[0041] 20ymol/L猪水疱病病毒特异下游引物SEQ ID NO. 20 0? 2yL,
[0042] 20ymol/L蓝舌病病毒特异上游引物SEQ ID NO. 210. 2yL,
[0043] 20ymol/L蓝舌病病毒特异下游引物SEQ ID NO. 22 0? 2yL,
[0044] 20 y mol/L小反刍兽疫病毒特异上游引物SEQ ID NO. 23 0? 2 y L,
[0045] 20 y mol/L小反刍兽疫病毒特异下游引物SEQ ID NO. 24 0? 2 y L,
[0046] 20ymol/L PCR 通用上游引物 SEQ ID NO. 25 4yL，
[0047] 20 ymol/L PCR 通用下游引物 SEQ ID NO. 26 1 y L ;
[0048]按如下步骤进行扩增：94°C 5min ;94°C 30sec，58°C 30sec，72°C 25sec 循环 12 次； 94°C 30sec，5(TC 30sec，72°C 25sec 循环 30 次；72°C lOmin ;
[0049] (3)杂交：首先配制杂交液：杂交缓冲液7. 8 y L、PCR扩增产物7 y L、杂交阳性对 照0. 2 y L，混匀后95°C变性8min，冰上放置5min，然后采用15 y L杂交液进行杂交；其中 杂交缓冲液每1000 u L包括20 X SSC 500 y L、10 % SDS 10 y L及无核酸酶灭菌水490 y L。
[0050] (4)结果判读：用微阵列芯片扫描仪扫描分析，去除阴性对照背景，与芯片杂交说 明对照，判定结果。
[0051] 本发明具有如下优点：
[0052](1)成功地构建了FMDV&VSV&SVDV&BTV&PPRV检测基因芯片：本发明所制备的基因 芯片采用的各条筛选探针可与对应病毒目的基因进行特异性结合，杂交信号较强且稳定。
[0053] (2)制备的检测基因芯片具有良好的方法学特征：本发明建立了一种特异性好、 灵敏度高、稳定性强和节时省力的基因芯片检测方法。
[0054](3)检测基因芯片的构建，为混合感染疾病的同步检测和鉴别诊断提供快速、高效 的手段，为今后出入境动物检疫和相应疫病控制提供了技术保障。对满足进出境动物检疫 工作的需要，控制口蹄疫病毒、水疱性口炎病毒、猪水疱病病毒、小反刍兽疫病毒和蓝舌病 病毒的传播，保障我国的畜牧业安全、健康发展具有十分重要的意义。
【附图说明】
[0055] 图1芯片探针分布示意图；
[0056] 图2 口蹄