,
[0124] 20ymol/L蓝舌病病毒特异下游引物SEQ ID NO. 220.2 yL,
[0125] 20ymol/L小反刍兽疫病毒特异上游引物SEQ ID N0.23 0.2 yL,
[0126] 20ymol/L小反刍兽疫病毒特异下游引物SEQ ID NO. 24 0.2 yL,
[0127] 20ymol/L PCR 通用上游引物 SEQ ID NO. 25 4yL，
[0128] 20 ymol/L PCR 通用下游引物 SEQ ID NO. 26 1 y L ;
[0129] 口蹄疫A型病毒特异上游引物SEQ ID NO. 11 :
[0130] 5， -AGGTGACACTATAGAATAGGGTGATCTAGGGTCTCTCGC~3/ ；
[0131] 口蹄疫A型病毒特异下游引物SEQ ID NO. 12 :
[0132] 5， -GTACGACTCACTATAGGGACAGGAGCTGCTTTGCAGGTGCAAT~3/ ；
[0133] 口蹄疫亚洲I型病毒特异上游引物SEQ ID NO. 13 :
[0134] 5，-AGGTGACACTATAGAATAACTGCCTACCAGAAGCAACC~3/；
[0135] 口蹄疫亚洲I型病毒特异下游引物SEQ ID NO. 14 :
[0136] 5， -GTACGACTCACTATAGGGAAGTATGTCTCCGCACGCTTC~3 /；
[0137] 口蹄疫0型病毒特异上游引物SEQ ID NO. 15 :
[0138] 5，-AGGTGACACTATAGAATAGTGACTGAACTGCTTTACCGCAT~3/；
[0139] 口蹄疫0型病毒特异下游引物SEQ ID NO. 16 :
[0140] 5， -GTACGACTCACTATAGGGAGACATGTCCTCCTGCATCTG~3 /；
[0141] 水疱性口炎病毒特异上游引物SEQ ID NO. 17 :
[0142] 5' -AGGTGACACTATAGAATATGATACAGTACAATTATTTTGGGA-3,
[0143] 水疱性口炎病毒特异下游引物SEQ ID NO. 18 :
[0144] 5' -GTACGACTCACTATAGGGAGAGACTTTCTGTTAGGGATCTGG-3'
[0145] 猪水疱病病毒特异上游引物SEQ ID NO. 19 :
[0146] 5' -AGGTGACACTATAGAATATTCAGAATGATTGCATATGGGG-3,
[0147] 猪水疱病病毒特异下游引物SEQ ID NO. 20 :
[0148] 5' -GTACGACTCACTATAGGGATCACGTTTGTCCAGGTTACC-3'
[0149] 蓝舌病病毒特异上游引物SEQ ID NO. 21 :
[0150] 5' -AGGTGACACTATAGAATAATGCTATCCGGGCTGATCCRA-3'
[0151] 蓝舌病病毒特异下游引物SEQ ID NO. 22 :
[0152] 5' -GTACGACTCACTATAGGGATCACRTCATCACGAAACGCTT C_3，
[0153] 小反刍兽疫病毒特异上游引物SEQ ID NO. 23 :
[0154] 5' -AGGTGACACTATAGAATA ACGAACCGTTAGAGGGACTGG-3,
[0155] 小反刍兽疫病毒特异下游引物SEQ ID NO. 24 :
[0156] 5' -GTACGACTCACTATAGGGATCCTTCCTTCGGACCCATTTGG-3'
[0157] PCR通用上游引物SEQ ID NO. 25 :5' -cy3-AGGTGACACTATAGAATA-3'，
[0158] PCR通用下游引物SEQ ID NO. 26 :5' -GTACGACTCACTATAGGGA-3'。
[0159] 2、扩增：将配置好的反应液置于PCR扩增仪中，按照表1的PCR反应循环程序进行 PCR反应。
[0160] 表1PCR反应程序
[0161]
【主权项】
1. 用于检测？1?￥、￥5￥、3￥0￥、？?1^和817的基因芯片，包括屮〇?反应混合液管、1&9聚 合酶、PCR阳性对照、PCR阴性对照、ddH20、检测芯片、芯片探针的点样分布、芯片盖片、杂交 液、杂交阳性对照和杂交盒，采用基因芯片微量点样技术，将待测样品探针与各种质控探针 固定在经过化学修饰的醛基基片上，形成的微阵列，其特征是：所述微阵列包括质控探针区 和待测样品探针区，其中所述质控探针区内设置下述分区： 点样位置质控分区（Pl)，包含至少一个点样位置质控探针：SEQIDNO. 9; 杂交阳性质控分区（P2)，包含至少一个杂交阳性质控探针：SEQIDNO. 10 ; 杂交阴性质控分区（N)，包含点样缓冲液； 所述待测样品探针区包含以下至少一个待测样品探针的分区： 口蹄疫病毒A型探针分区（1)， 口蹄疫病毒亚洲I型探针分区（2)， 口蹄疫病毒通用型探针分区（3)， 口蹄疫病毒〇型探针分区（4)， 水疱性口炎病毒探针分区（5)， 猪水疱病病毒探针分区（6)， 蓝舌病病毒探针分区（7)， 小反刍兽疫病毒探针分区（8); 各个探针序列如下： 口蹄疫病毒A型探针：SEQIDNO. 1 ; 口蹄疫病毒亚洲I型探针：SEQIDNO. 2 ; 口蹄疫病毒通用型探针：SEQIDNO. 3 口蹄疫病毒〇型探针：SEQIDNO. 4 ; 水疱性口炎病毒探针：SEQIDNO. 5 ; 猪水疱病病毒探针：SEQIDNO. 6 ; 蓝舌病病毒探针：SEQIDNO. 7 ; 小反刍兽疫病毒探针：SEQIDNO. 8。
2. 根据权利要求1所述用于检测FMDV、VSV、SVDV、PPRV和BTV的基因芯片，其特征是： 每张所述检测芯片上包括至少一个权利要求1所述的微阵列，每个微阵列可以检测一份样 品。
3. 根据权利要求1所述用于检测FMDV、VSV、SVDV、PPRV和BTV的基因芯片，其特征是： 所述每条质控探针和待测样品探针的5'端均通过15个胸腺嘧啶核苷酸连接有一个氨基。
4. 利用权利要求1所述基因芯片用于检测口蹄疫病毒、水疱性口炎病毒、猪水疱病病 毒、小反刍兽疫病毒和蓝舌病病毒的非疾病诊断目的的检测方法，包括如下步骤： (1) 待测样品制备：按照商品化RNA提取试剂盒使用说明书提取待检组织或病毒的细 胞增殖液的全基因组，进行反转录制备用于检测的cDNA，作为待测样品DNA; (2)PCR扩增：25yLPCR反应液包含：rTaq酶12.5yL、引物Mix7.8yL、待测样品DNA 3yL、无核酸酶灭菌水I. 7yL; 其中，所述引物Mix含有： 20ymol/L口蹄疫A型病毒特异上游引物SEQIDNO. 11 0.2yL， 20ymol/L口蹄疫A型病毒特异下游引物SEQIDNO. 12 0. 2yL， 20ymol/L口蹄疫亚洲I型病毒特异上游引物SEQIDNO. 13 0. 2yL， 20ymol/L口蹄疫亚洲I型病毒特异下游引物SEQIDNO. 14 0. 2yL， 20ymol/L口蹄疫0型病毒特异上游引物SEQIDNO. 15 0. 2yL， 20ymol/L口蹄疫0型病毒特异上游引物SEQIDNO. 16 0. 2yL， 20ymol/L水疱性口炎病毒特异上游引物SEQIDNO. 17 0.2yL， 20ymol/L水疱性口炎病毒特异下游引物SEQIDNO. 18 0.2yL， 20ymol/L猪水疱病病毒特异上游引物SEQIDNO. 19 0.2yL， 20ymol/L猪水疱病病毒特异下游引物SEQIDNO. 20 0.2yL， 20ymol/L蓝舌病病毒特异上游引物SEQIDNO. 21 0.2yL， 20ymol/L蓝舌病病毒特异下游引物SEQIDNO. 22 0.2yL， 20ymol/L小反刍兽疫病毒特异上游引物SEQIDNO. 23 0.2yL， 20ymol/L小反刍兽疫病毒特异下游引物SEQIDNO. 24 0.2yL， 20ymol/LPCR通用上游引物SEQIDN025 4yL， 20ymol/LPCR通用下游引物SEQIDN026IyL; 按如下步骤进行扩增：94°C5min;94°C30sec，58°C30sec，72°C25sec循环 12 次； 94°C30sec，5(TC30sec，72°C25sec循环 30 次；72°CIOmin; (3) 杂交：首先配制杂交液：杂交缓冲液7. 8yL、PCR扩增产物7yL、杂交阳性对照 0. 2yL，混匀后95°C变性8min，冰上放置5min，然后采用15yL杂交液进行杂交； (4) 结果判读：用微阵列芯片扫描仪扫描分析，去除阴性对照背景，与芯片杂交说明对 照，判定结果。
5.根据权利要求4所述检测方法，其特征是：所述杂交缓冲液每1000yL包括20XSSC500yL、10%SDS10yL及无核酸酶灭菌水490yL。
【专利摘要】本发明公开了一种用于检测FMDV、VSV、SVDV、PPRV和BTV的基因芯片及其检测方法，包括口蹄疫病毒(A型、亚洲I型、O型)、水疱性口炎病毒、猪水疱病病毒、小反刍兽疫病毒和蓝舌病病毒的检测。通过标准毒株基因组序列分析设计PCR引物，对目的基因克隆及测序分析，然后设计特异性探针，可对口蹄疫病毒、水疱性口炎病毒、猪水疱病病毒、小反刍兽疫病毒和蓝舌病病毒进行同时检测。本发明旨在建立一种灵敏度高、特异性强、节时省力并且易于观察结果的微阵列芯片检测口蹄疫病毒、水疱性口炎病毒、猪水疱病病毒、小反刍兽疫病毒和蓝舌病病毒的方法。
【IPC分类】C40B40-06, C12R1-93, C12Q1-68, C12Q1-70
【公开号】CN104694668
【申请号】CN201510078232
【发明人】聂福平, 李应国, 王昱, 杨俊 , 保雨, 王国民, 艾军, 张强
【申请人】重庆出入境检验检疫局检验检疫技术中心
【公开日】2015年6月10日
【申请日】2015年2月13日