一种快速检测表皮葡萄球菌的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物工程技术领域，涉及一种快速检测表皮葡萄球菌的方法，具体为 一种表皮葡萄球菌的特异基因的发现及其应用于表皮葡萄球菌检测技术方法的建立。
【背景技术】
[0002] 表皮葡萄球菌是存在于皮肤表面的条件致病菌，其引起败血症，慢性前列腺炎的 趋势以日俱增。表皮葡萄球菌的耐药现象非常严重，临床上治疗表皮葡萄球菌所致疾病较 为棘手。因此，快速检测出表皮葡萄球菌就显得尤为重要。
[0003] 目前临床应用的表皮葡萄球菌的检测方法有常规涂片镜检法、培养法、免疫学测 定、仪器自动分析鉴定系统等，但是这些方法都存在一定的缺陷，如常规涂片镜检是最基本 的细菌学检查方法，但是敏感性低，特异性差；培养法是目前临床上发现传染源的主要途径 和手段，但其非常耗时，不能实现快速的目的；免疫学测定方法对培养基的含盐量有很高的 要求，若含盐量比较高，那么蛋白的合成会受到抑制，而出现假阴性；近年来，仪器自动化分 析鉴定系统不断面市，但这些鉴定系统大多数应用面较窄，费用昂贵。
[0004] 本发明利用生物信息学寻找出表皮葡萄球菌特异基因，并针对其设计引物，建立 了表皮葡萄球菌的检测方法，实现了简便、快速、准确的检测出表皮葡萄球菌的目的。
【发明内容】
[0005] 本发明针对现有技术对表皮葡萄球菌检测技术的缺陷，目的在于提供一种高特异 高敏感检测的快速检测表皮葡萄球菌的方法，通过物信息学手段获取可用于鉴定表皮葡萄 球菌的基因，并设计可以特异性检测表皮葡萄球菌的引物，利用聚合酶链式反应鉴定表皮 葡萄球菌的方法。
[0006] 本发明具体通过以下技术方案实现：
[0007] -种快速检测表皮葡萄球菌的方法，通过生物信息学手段获取用于鉴定表皮葡萄 球菌的基因，并针对该基因，设计上游引物如SEQ ID NO: 1所示，下游引物如SEQ ID NO :2 所示，进行PCR扩增，扩增产物在琼脂糖凝胶中电泳，获得检测结果。
[0008] 本发明所述的鉴定表皮葡萄球菌的基因为DeoR family transcriptional regulator，该基因 Genbank登陆号为3240916,为表皮葡萄球菌特有，基因序列如SEQ ID NO : 3所示。
[0009] 本发明所述的PCR反应体系为：25 μ L，Taq 0. 125 μ L，10 X聚合酶缓冲液2. 5 μ L， dNTP 2 μ L，Mg2+L 6 μ L，模板 1 μ L，上下游引物各 1 μ L，加 CldH2O 补足 25 μ L。
[0010] 本发明所述的PCR反应程序为：1)预变性：95°C 5min ;2)30个循环：95°C 30s， 59°C 30s，72°C 20s ;3)后扩增：72°C lmin。
[0011] 本发明快速检测表皮葡萄球菌的方法在Mg2+为I. 6mM，退火温度为59°C条件下进 行。
[0012] 所述引物组合物与鉴定表皮葡萄球菌的基因的246位至705位的核苷酸序列或其 互补链互补。
[0013] 本发明还提供了一种用于应用聚合酶链式反应鉴定表皮葡萄球菌的引物组合物， 所述的引物组合物为：上游引物如SEQ ID NO: 1所示，下游引物如SEQ ID NO :2所示。
[0014] 本发明还提供了基因 DeoR family transcriptional regulator (Gen bank 登陆 号为3240916)用于鉴定表皮葡萄球菌的用途。
[0015] 本发明的有益效果为通过本地Blast比对和分析，获得表皮葡萄球菌的特异基 因，针对特异基因设计特异引物，该引物可以快速、简便、准确的检测表皮葡萄球菌。
【附图说明】
[0016] 图1是不同退火温度和Mg2+浓度下检测表皮葡萄球菌电泳图；A为退火温度49°C; B为退火温度51°C ;C为退火温度53°C ;D为退火温度55°C ;E为退火温度57°C ;F为退火温 度 59°C ;M 为 2000bp marker，1 ~5 依次为 0· 8、L 6、2. 4、3. 2、4. OmM ;
[0017] 图2是Mg2+为1.6mM、退火温度为59°C的条件下检测表皮葡萄球菌电泳图；M为 2000bp marker，1至3为三株表皮葡萄球菌，4为肺炎克雷伯菌，5为弗劳地氏枸橼酸杆菌， 6为伤寒杆菌，7为琼氏不动杆菌，8为大肠杆菌，9为粪肠球菌，10为溶血葡萄球菌，11为金 黄色葡萄球菌，12为摩氏摩根菌；
[0018] 图3是检测不同表皮葡萄球菌浓度的电泳图；M为2000bp mar ker，0至9分别为 为100个/ μ L至109个/ μ L，C为阴性对照。
【具体实施方式】
[0019] 下面结合实施例对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施 例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示 的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明 的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。
[0020] 实施例1
[0021] 一种快速检测表皮葡萄球菌的方法，具体通过以下步骤完成：
[0022] 一、特异性靶基因筛选及引物设计
[0023] 从 NCBI (http://www. ncbi. nlm. nih. gov/genome/)中下载的表皮葡萄球菌全基 因组序列，对本地的核酸数据库进行本地BLAST检索，获取得到表皮葡萄球菌各序列片段 与数据库比对结果。
[0024] 使用在线BLAST功能，使用2种策略确认其菌种特异性和表皮葡萄球菌鉴定可 用性。一种策略为BLAST时排除表皮葡萄球菌，结果显示无任何相似序列者为表皮葡萄 球菌特异基因；第二种策略为BLAST时选择在表皮葡萄球菌内进行检索，结果返回大量 相似序列者是不同表皮葡萄球菌菌株共有序列。结合两种策略，最终得出DeoR family transcriptional regulator符合两种策略标准，基因 Genbank登陆号为3240916,基因序 列如SEQ ID NO : 3所示。
[0025] 针对表皮葡萄球菌DeoR family transcriptional regulator基因，设计特异引 物：上游引物如SEQ ID NO: 1所示，下游引物如SEQ ID NO :2所示。表皮葡萄球菌特异引 物通过在线设计特异性寡核苷酸引物工具Primer-BLAST设计完成。设计步骤和注意事项 参照Primer-BLAST使用说明书进行。
[0026] 二、检测方法的建立
[0027] DNA的提取，用北京庄盟国际生物基因科技有限公司的细菌基因组DNA小量提取 试剂盒进行抽提回收，步骤如下：
[0028] 1)取细菌培养液5mL，12, OOOrpm离心1分钟，尽量吸净上清。
[0029] 2)向留有菌体沉淀的离心管中加入500 μ L细胞悬浮液，使用移液器或涡旋振荡 器彻底悬浮细菌细胞沉淀，37°C温浴30分钟。每隔10分钟颠倒混匀数次。12, OOOrpm离心 2分钟，尽量吸净上清。
[0030] 3)向菌体沉淀中加入225 μ L缓冲液A，振荡至菌体彻底悬浮。
[0031] 4)向管中加入6yL RNaseA溶液，振荡15秒，室温放置5分钟。
[0032] 5)向管中加入10 μ L蛋白酶K溶液，颠倒混匀。
[0033] 6)加入25 μ L裂解缓冲液S，颠倒混匀。
[0034] 7)加入250 yL缓冲液Β，振荡10秒，70°C放置10分钟。12,000rpm离心1分钟， 取上清放入一新管中，弃去沉淀。
[0035] 8)加入250 μ L无水乙醇，充分振荡混匀15秒，此时可能会出现絮状沉淀，瞬时离 心以去除管盖内壁的水珠。
[0036] 9)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱中（吸附柱放入收集管中）， 12, OOOrpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱放入收集管中。
[0037] 10)向吸附柱中加入500 μ L缓冲液C，12, OOOrpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱 放入收集管中。
[0038] 11)向吸附柱中加入700 μ L漂洗液W2,12, OOOrpm离心30秒，倒掉废液，吸附柱放 入收集管中。
[0039] 12)向吸附柱中加入500 μ L漂洗液W2,12, OOOrpm离30秒，倒掉废液，将吸附柱放 回收集管中。然后12, OOOrpm离心2分钟。将吸附柱置于一个新的1.5mL离心管中，室温 放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
[0040] 13)将吸附柱转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加100 μ L洗 脱缓冲液ΤΕ，室温放置2分钟，12, OOOrpm离心2分钟，将溶液收集到离心管中。
[0041] 三、PCR条件优化：
[0042] 1)对退火温度和Mg2+同时进行优化。退火温度为6个梯度，49、51、53、55、57、59 °C。 Mg2+浓度为5个梯度，0. 8、1. 6、2. 4、3. 2和4. OmM。所述通过聚合酶链式反应检测表皮葡萄 球菌条件优化扩增体系为25 μ L。具体反应体系为：TaqDNA聚合酶0. 125 μ L，10 X聚合酶 缓冲液 2. 5 μ L，dNTP 2 μ L，Mg2+分别为 0. 8、I. 6、2. 4、3. 2 和 4. OmM，模板 1 μ L，上下游引物 各 I