pm离心30-60秒，倒掉收集管中的 废液，将吸附柱放入收集管中。
[0113] ⑥向吸附柱中加入500 μ L漂洗液W2,12, OOOrpm离心60秒，倒掉收集管中的废 液，将吸附柱放入收集管中。
[0114] ⑦将吸附柱放入收集管中，12, OOOrpm离心2分钟，置于室温放置数分钟，以彻底 晾干吸附材料中残余的漂洗液。
[0115] ⑧将吸附柱置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位滴加60 μ L洗脱
[0116] 缓冲液ΤΕ，室温放置2分钟，12, OOOrpm离心1分钟将质粒溶液收集到离心管中。
[0117] 二、表皮葡萄球菌灵敏度
[0118] 1)质粒数目换算
[0119] 用紫外分光光度计测得质粒浓度为：188ng/yL。
[0120] 质粒数目换算公式：（注：X为质粒浓度；Y为质粒碱基对数；NA为阿伏伽德罗常 数；2692为载体碱基对数；660为碱基平均分子量）得到DeoR family transcriptional regulator 的浓度为 9· 04 X 109 个 / μ L。
[0121] 2)取 1 μ L DeoR family transcriptional regulator 阳性质粒稀释到 I. 0X 109 个/yL，取2 yL稀释好的阳性质粒进行10倍梯度稀释，稀释成1.0 X 108至1.0 X 1009个 梯度。分别取每个梯度稀释液2 μ L为模板。反应体系为25 μ L，Taq 0. 125 μ L, IOX聚合酶 缓冲液2. 5 μ L, dNTP 2 μ L，Mg2+L 6 μ L，模板2 μ L，上下游引物各1 μ L，加 CldH2O补足25 μ L。
[0122] 3)在PCR仪中按以下程序扩增：
[0123] 预变性：
[0124] 95 〇C 5 分钟
[0125] 30个循环：
[0126] 95 〇C 30 秒钟
[0127] 59 〇C 30 秒钟
[0128] 72 〇C 20 秒钟
[0129] 后扩增：
[0130] 72 〇C 1 分钟
[0131] 在Mg2+为I. 6mM，退火温度为59°C的条件下，该检测方法可以检测到表皮葡萄球菌 的最低浓度为1个/yL，如图3所示。
[0132] 序列表 <110〉云南省第一人民医院 <120〉一种快速检测表皮葡萄球菌的方法 <130> 2014 <160> 5 <170> PatentIn version 3. 5 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 1 gctaaacgtg ctgcatgtga 20 <210> 2 <211> 21 <212> DNA 〈213>人工序列 <400> 2 tgctttgcat tgctttttgc g 21 <210> 3 <211〉 759 <212> DNA 〈213> 人工序列 <400> 3 gtgatatcag aaaaacgaca gaatttaatt ttacaagaat taactcaaaa ggacttttta 60 acacttcaag atttagttga tagaacagga tgtagtgcat caactatacg aagagattta 120 tctaagtlgc agaatatggg laaattacaa cgaglacatg gtgglgctac aattcatcaa 180
[0133] aatcgagtta aggaacctaa gttatctgaa aaaagaactc agaatttacg tgaaaaacaa 240 gaaatcgcta aacgtgctgc atgtgatatc caagatcatg aatgtatatt tctagatgcg 300 ggttcctcaa cttttgagtt aaltcaatal attgaggcaa aagataltac tgttglaaca 360 aacggaatga cacatgLtga agaactatia aagcacggta ttaaaacLti aa tggtiggt 420 ggccaagtta aacctacgac aatggctaca gttggtgcta acgcgttaga aacattaaga 480 cgttattgtt ttgatcgtgc ttttatagga atgaacggta ttgatgtgaa atatggatta 540 acaacccctg atgaacaaga agctttgatt aaagaaacag ctatgaaact atcaaatcac 600 aaatatgtgc ttgtcgatca atcaaagttt aatcaaattt attttgcaag agttccaatt fc>bU ttagatggac ttagcatcat aacttcgcaa aaagcaatgc aaagcaagat gactgaagct 720 tacatgaatg aatttaattt tataggaggg aaatcatga 759 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213〉人工序列 <400> 4 cgccagggtt ttcccagtca cgac 24 <210> 5 <211> 460 <212> DNA <213〉人工序列 <400〉 5 gctaaacgtg ctgcatgtga talccaagat catgaatgta tatttxiaga tgcgggttcc 60 tcaacttttg agttaattca atatattgag gcaaaagata ttactgttgt aacaaacgga 120 atgacacatg ttgaagaact attaaagcac ggtattaaaa ctttaatggt tggtggccaa 180 gttaaaccta cgacaatggc tacagttggt gctaacgcgt tagaaacart aagacgttat 240
[0134] tgttttgatc gtgcttttat aggaatgaac ggtattgatg tgaaatatgg attaacaacc 300 CGtgatgaac aagaagcttt gattaaagaa acagctatga aactatcaaa tcacaaatat 360 gtgcttgtcg atcaatcaaa gtttaatcaa atttattttg caagagttcc aattttagat 420 ggaottagca tcataacttc gcaaaaagca atgcaaagca. 460
【主权项】
1. 一种快速检测表皮葡萄球菌的方法，其特征在于：通过生物信息学手段获取用于鉴 定表皮葡萄球菌的基因，并针对该基因，设计上游引物如SEQIDNO:1所示，下游引物如SEQ IDNO: 2所示，进行PCR扩增，扩增产物在琼脂糖凝胶中电泳，获得检测结果。
2. 根据权利要求1所述的一种快速检测表皮葡萄球菌的方法，其特征在于：所述的鉴 定表皮葡萄球菌的基因序列如SEQIDNO:3所示。
3. 根据权利要求1所述的一种快速检测表皮葡萄球菌的方法，其特征在于：所述的PCR 反应体系为：25yL，Taq0? 125yL，10X聚合酶缓冲液 2. 5yL，dNTP2yL，Mg2+L6yL，模 板IyL，上下游引物各IyL，加ddH20补足25yL。
4. 根据权利要求1所述的一种快速检测表皮葡萄球菌的方法，其特征在于：所述的PCR 反应程序为：1)预变性：95°C5min;2)30 个循环：95°C30s，59°C30s，72°C20s;3)后扩增： 72°CImin〇
5. 根据权利要求1所述的一种快速检测表皮葡萄球菌的方法，其特征在于：在Mg2+为 I. 6禮，退火温度为59°C条件下进行。
6. -种聚合酶链式反应鉴定表皮葡萄球菌的引物组合物，其特征在于：所述的引物组 合物为：上游引物如SEQIDNO:1所示，下游引物如SEQIDNO:2所示。
7. 权利要求1或2所述的鉴定表皮葡萄球菌的基因用于鉴定表皮葡萄球菌的应用。
8. 根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述的鉴定表皮葡萄球菌的基因序列如 SEQIDNO: 3 所示。
【专利摘要】本发明公开了一种快速检测表皮葡萄球菌的方法，通过生物信息学手段获取用于鉴定表皮葡萄球菌的基因，并针对该基因，设计上游引物如SEQ ID NO：1所示，下游引物如SEQ ID NO：2所示，进行PCR扩增，扩增产物在琼脂糖凝胶中电泳，获得检测结果，所述的鉴定表皮葡萄球菌的基因序列如SEQ ID NO：3所示。本发明方法针对特异基因设计特异引物，该引物可以快速、简便、准确的检测表皮葡萄球菌。
【IPC分类】C12Q1-68, C12R1-45, C12Q1-14
【公开号】CN104726565
【申请号】CN201510089896
【发明人】毛小琴, 刘有福, 贾雄飞, 宋玉竹, 张阿梅
【申请人】云南省第一人民医院
【公开日】2015年6月24日
【申请日】2015年2月27日