一种快速检测水貂病毒性肠炎病毒的双重pcr方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种快速检测水貂病毒性肠炎病毒的双重PCR方法，属于病毒分子生 物学领域。 (二）
【背景技术】
[0002] 水紹病毒性肠炎病毒（Mink enteritis virus，MEV)可引起水紹病毒性肠炎（Mink viral enteritis)，水貂病毒性肠炎是一种急性、高度接触性传染疾病，该病以腹泻为主要 特征，具有较高的发病率和死亡率，是世界公认的危害水貂养殖业的重要病毒性传染病之 一，严重妨碍了养貂业的健康发展。因此，及时快速检测水貂病毒性肠炎病毒，在生产实践 中具有重要的作用，对水貂病毒性肠炎的预防具有重大意义。
[0003] 目前在实际生产中，检测水貂病毒性肠炎病毒常用的方法有间接免疫荧光技术、 琼扩试验、血凝/血凝抑制试验以及ELISA等，这些方法存在或敏感性不高、或特异性不强 等缺点。随着分子生物学和生物试剂的不断发展和改善，PCR检测方法已经成为病毒检测 的重要技术。因此可以针对MEV的结构蛋白（VP2)和非结构蛋白（NSl)设计两对引物，建 立PCR方法对MEV进行检测。目前，在我国水貂群中MEV普遍存在，应用双重PCR方法检测 MEV的方法还没有建立，所建立的检测MEV的双重PCR方法具有省时省力、特异性强、敏感性 高的高通量检测方法，为MEV的检疫提供一种新的检测方法。 (三）
【发明内容】
[0004] 为了解决上述问题，本发明提供了一种快速检测水貂病毒性肠炎病毒的双重PCR 方法，是一种用于非疾病诊断目的的快速检测方法，主要涉及一组用于快速检测水貂病毒 性肠炎病毒的特异性引物。本发明设计并筛选了新的特异性引物，优化了反应过程中的各 种参数，建立了检测MEV的双重PCR方法，特异性更强、敏感性更高，可以快速准确地进行 MEV的检测。
[0005] 一组用于快速检测水貂病毒性肠炎病毒的特异性引物，是通过对GenBank上已发 表的MEV的基因序列进行比对，选择在MEV的非结构蛋白NSl基因的保守区与结构蛋白VP2 基因的保守区，分别设计一对针对NSl基因片段的特异性引物SEQ. ID. NO 1/SEQ. ID. NO 2 和一对针对VP2基因片段的特异性引物SEQ. ID. NO 3/SEQ. ID. NO 4。
[0006] SEQ. ID. NO I :5' -GGTTAGCTAAACATGGTTATG-3' ；
[0007] SEQ. ID. NO 2 :5' -GAGTCAGAGGAGTTAGAACG-3' ；
[0008] SEQ. ID. NO 3 :5' -CTTTGCCTCAATCTGAAGGAGT-3' ；
[0009] SEQ. ID. NO 4 :5' -GAATTGGATTCCAAGTATGAGAT-3'。
[0010] 所有引物以无菌ddH20(Rnase free)配成20pmol/ μ I的浓度备用。
[0011] 上述引物的使用方法如下：
[0012] A、以 MEV DNA 为模板进行PCR 反应。反应体系为：17. 3μ1 CldH2O (Rnase free)， 2· 5 μ I Buffer，2 μ I dNTPs (10.0 mM)，SEQ. ID. NO 1 和 SEQ. ID. NO 2 各 I. 0 μ 1，SEQ. ID. NO 3 和 SEQ. ID. NO 4 各 1.0 μ 1，1 μ I DNA 模板，0· 2 μ I Taq 酶。PCR 反应条件为：95°C 5min ; 94°C 30s，53°C 30s，72°C lmin，32 个循环；72°C lOmin。
[0013] B、对步骤A得到的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测：
[0014] 如果同时扩增出了 191bp和824bp的产物，则该样品为阳性，样品中含有MEV ;如 果只扩增出扩增出191bp或824bp的产物，则该样品可疑；如果未扩增出191bp和824bp的 产物，则该样品不含有MEV。
[0015] 本发明的双重PCR方法最低可检测到IO2个拷贝MEV的病毒DNA，表明本方法具有 很尚的灵敏性。
[0016] 用建立的双重PCR方法对威海、诸城、菏泽、临沂、大连等地30个水貂养殖场场送 检的72只MEV分离呈阳性的水貂器官组织进行检测，结果发现所有样品的检测结果与病毒 分离培养检测结果符合率为100%，说明本发明建立的双重PCR方法适合于MEV的快速检 测。 (四）【附图说明】
[0017] 图1单重PCR的特异性检测结果
[0018] M，DNA Marker DL2000 ;用 SEQ. ID. NO 1/SEQ. ID. NO 2 分别扩增：1. MEV，2.貂犬瘟 热病毒，3.水貂阿留申病病毒，4.健康水貂脾脏组织；用SEQ. ID. NO 3/SEQ. ID. NO 4分别扩 增，5. MEV，6.貂犬瘟热病毒，7.水貂阿留申病病毒，8.健康水貂脾脏组织。
[0019] 图1说明本专利所设计引物SEQ. ID. NO 1/SEQ. ID. NO 2只能扩增出MEV的NSl 基因片段，而对貂犬瘟热病毒、水貂阿留申病病毒、健康水貂脾脏组织扩增阴性；SEQ. ID. NO 3/SEQ. ID. NO 4只能扩增出MEV的VP2基因片段，而对貂犬瘟热病毒、水貂阿留申病病毒、 健康水貂脾脏组织扩增阴性。结果表明SEQ. ID. NO 1/SEQ. ID. NO 2与SEQ. ID. NO 3/SEQ. ID. NO 4具有很强的特异性。
[0020] 图2双重PCR的特异性检测结果
[0021] M，DNA Marker DL2000 ;1·用引物 SEQ. ID. NO 1/SEQ. ID. NO 2 与引物 SEQ. ID. NO 3/SEQ. ID. NO 4 双重 PCR 扩增 MEV ;2,用引物 SEQ. ID. NO 1/SEQ. ID. NO 2 扩增 MEV ;3,用 引物 SEQ. ID. NO 3/SEQ. ID. N04 扩增 MEV ;用引物 SEQ. ID. NO 1/SEQ. ID. NO 2 与引物 SEQ. ID. NO 3/SEQ. ID. NO 4双重PCR分别扩增，4.貂犬瘟热病毒，5.水貂阿留申病病毒，6.绿脓 杆菌感染的水貂肺脏，7.双球菌，8.克雷伯氏菌，9.巴氏杆菌，10.大肠杆菌，11.健康水貂 脾脏组织。
[0022] 用 SEQ. ID. NO 1/SEQ. ID. NO 2 与 SEQ. ID. NO 3/SEQ. ID. NO 4 两对引物建立的检测 MEV的双重PCR方法只能扩增出MEV的NSl基因片段与VP2基因片段，而对貂犬瘟热病毒、 水貂阿留申病病毒、绿脓杆菌感染的水貂肺脏、双球菌、克雷伯氏菌、巴氏杆菌、大肠杆菌、 健康水貂脾脏组织等扩增阴性。结果表明用SEQ. ID. NO 1/SEQ. ID. NO 2与SEQ. ID. NO 3/ SEQ. ID. NO 4两对引物建立的检测MEV的双重PCR方法具有很强的特异性。
[0023] 图3双重PCR针对MEV感染水貂脾脏总DNA的敏感性检测结果
[0024] M，DNA Marker DL2000 ;所提组织病料模板DNA的浓度对应组织病料的量分别是， I. Img/μ L，2. IOOng/μ L，3. IOng/μ L，4. Ing/μ L，5. IOOpg/μ L，6. IOpg/μ L，7. Ipg/μ L。 结果表明，所建立双重PCR方法与单重PCR的敏感度一致，最低可检测到IOpg/ μ L的组织 总DM〇
[0025] 图4双重PCR针对MEV的DNA模板的敏感性检测结果
[0026] M，DNA Marker DL2000 ;M, DL2000 ; 1-11，分别为 IOici-IO?拷贝的 MEV 的 DNA 模板。 结果表明，所建立检测MEV的双重PCR方法最低可检测到IO2个拷贝的病毒DNA。 (五）【具体实施方式】
[0027] 1引物设计
[0028] 通过对参考GenBank上已发表的ME