V序列进行比对，选择在NSl基因的保守区和 VP2基因的保守区分别设计一对针对NSl基因片段的特异性引物SEQ. ID. NOl/SEQ. ID. NO 2 和一对针对VP2基因片段的特异性引物SEQ. ID. N03/SEQ. ID. NO 4,利用下面所述2与3中 的方法对病毒样品进行扩增。
[0029] SEQ. ID. NO 1 :5' -GGTTAGCTAAACATGGTTATG-3' ；
[0030] SEQ. ID. NO 2 :5' -GAGTCAGAGGAGTTAGAACG-3' ；
[0031] SEQ. ID. NO 3 :5' -CTTTGCCTCAATCTGAAGGAGT-3' ；
[0032] SEQ. ID. NO 4 :5' -GAATTGGATTCCAAGTATGAGAT-3'。
[0033] NSl基因片段引物扩增片段大小为191bp，VP2基因片段引物扩增片段大小为 824bp。所有引物以无菌ddH20(Rnase free)配成20ρηιο1/μ1的浓度备用。
[0034] 2 单一 PCR
[0035] (1)单重PCR扩增反应体系：反应总体系为25μ1，包括17·3μ1 ddH20(Rnase free)，2· 5 μ I Buffer，2 μ I dNTPs (10.0 mM)，SEQ. ID. NO 1 和 SEQ. ID. NO 2 各 I. 0 μ 1，SEQ. ID. NO 3 和 SEQ. ID. NO 4 各 I. 0 μ 1，1 μ I DNA 模板，0· 2 μ I Taq 酶。PCR 反应条件为：95°C 5min;94°C 30s，53°C 30s，72°C lmin，32 个循环；72°C 10min。
[0036] (2)分别用引物 SEQ. ID. NO 1/SEQ. ID. NO 2 与引物 SEQ. ID. NO 3/SEQ. ID. NO 4 对 MEV、貂犬瘟热病毒、水貂阿留申病病毒、健康水貂脾脏组织进行上述单重PCR扩增，以检测 引物的特异性。分别将上述PCR产物与DNA电泳上样缓冲液混合，在1 %浓度的琼脂糖凝胶 中，以7~lOV/cm电压在IXTAE中进行电泳，在紫外灯下观察结果并用凝胶成像仪观察， 照相。结果表明，引物SEQ. ID. NO 1/SEQ. ID. NO 2只能扩增出MEV的NSl基因片段，PCR产 物大小为191bp，而对其他模板扩增阴性；引物SEQ. ID. NO 3/SEQ. ID. NO 4只能扩增出MEV 的VP2基因片段，PCR产物大小为824bp，而对其他病毒模板扩增阴性（见图1)。结果表明， 引物 SEQ. ID. NO 1/SEQ. ID. NO 2 与引物 SEQ. ID. NO 3/SEQ. ID. NO 4 具有很强的特异性，只 能分别针对MEV进行特异性扩增。
[0037] 3双重PCR条件的优化
[0038] 在单重PCR的基础上，对引物、dNTPs、Buffer的浓度，及退火温度等参数进行优 化，得到双重PCR最佳反应体系和反应程序。
[0039] 双重PCR :以病毒DNA为模板，反应总体积为25 μ 1，最佳反应体系为：15. 3 μ 1 CldH2O (Rnase free)，2. 5 μ I Buffer，2. 0 μ I dNTP Mixture (10.0 mM)，SEQ. ID. NO 1 和 SEQ. ID. NO 2 各 I. 0 μ 1，SEQ. ID. NO 3 和 SEQ. ID. NO 4 各 I. 0 μ 1，I. 0 μ I DNA 模板，0· 2 μ I Taq 酶。
[0040] PCR 反应程序为：95°C 5min ;94°C 30s，53°C 30s，72°C lmin，32 个循环；72°C IOmin0
[0041] 4特异性试验
[0042] 以MEV、貂犬瘟热、水貂阿留申病病毒，绿脓杆菌感染的水貂肺脏、双球菌、克雷伯 氏菌、巴氏杆菌、大肠杆菌的菌株为模板分别用上述3中优化的条件进行双重PCR反应。对 双重PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果可知，建立的双重PCR方法只能特异性的针对MEV 进行扩增，对其他水貂常发病的病原扩增为阴性，可作为特异性鉴定MEV的快速方法（见图 2) 〇
[0043] 5敏感性试验
[0044] 提取感染水貂脾脏组织总DNA，所提DNA的浓度对应病料组织的量是Img/ μ L，将 所提DNA进行10 X梯度稀释，分别用来作为模板，进行单重和双重PCR对MEV的检测灵敏 度测定。结果可知，所建立双重PCR方法与单一 PCR的敏感度一致，最低可检测到IOpg/μ L 的组织总DNA(见图3)。
[0045] 用紫外分光光度计分别对本实验室构建的含有MEV的NSl基因片段与VP2基因片 段的质粒进行260nm/280nm0D值的测定，计算出纯度和含量，并将含有NSl基因片段质粒与 含有VP2基因片段质粒的浓度均调整IO ltl拷贝/μ L，然后分别对两种质粒进行IOX梯度 稀释释（即IOici-IOtl个拷贝），取每个稀释度分别进行双重PCR反应。结果表明，所建立检 测MEV的双重PCR方法最低可检测到IO 2个拷贝的病毒DNA(见图4)。
[0046] 6临床样本检测
[0047] 用建立的双重PCR方法对威海、诸城、菏泽、临沂、大连等地30个水貂养殖场场送 检的72只分离到MEV的水貂组织进行检测，结果发现所有样品的检测结果与病毒分离培养 检测结果符合率为100%，说明本发明建立的双重PCR方法适合于MEV的快速检测。
【主权项】
1. 一组用于快速检测水貂病毒性肠炎病毒的特异性引物，其特征在于选择在MEV的非 结构蛋白NSl基因的保守区与结构蛋白VP2基因的保守区，分别设计一对针对NSl基因片 段的特异性引物SEQ.ID.NO1/SEQ.ID.NO2和一对针对VP2基因片段的特异性引物SEQ. ID.NO3/SEQ.ID.NO4 ； SEQ.ID.NO1 :5' -GGTTAGCTAAACATGGTTATG-3' ； SEQ.ID.NO2 :5' -GAGTCAGAGGAGTTAGAACG-3' ； SEQ.ID.NO3 :5' -CTTTGCCTCAATCTGAAGGAGT-3' ； SEQ.ID.NO4 :5' -GAATTGGATTCCAAGTATGAGAT-3' ； 上述引物的使用方法如下： A、 以MEVDNA为模板进行PCR反应；反应体系为：17. 3yIddH20(Rnasefree)，2. 5yI Buffer，2yIdNTPs(10.OmM)，SEQ.ID.NO1 和SEQ.ID.NO2 各I. 0yI，SEQ.ID.NO3 和SEQ. ID.NO4各 1.0yl，lylDNA模板，0.2ylTaq酶；PCR反应条件为：95°C5min;94°C30s， 53°C30s，72°Clmin，32 个循环；72°CIOmin; B、 对步骤A得到的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测： 如果同时扩增出了 191bp和824bp的产物，则该样品为阳性，样品中含有MEV。
【专利摘要】本发明涉及一种快速检测水貂病毒性肠炎病毒的双重PCR方法，包括：分别合成MEV非结构蛋白NS1基因片段的特异性引物SEQ.ID.NO 1和SEQ.ID.NO 2，MEV结构蛋白VP2基因片段的特异性引物SEQ.ID.NO 3和SEQ.ID.NO 4，以上述两对引物为双重引物，以MEV的DNA为模板，在同一反应体系中进行PCR反应，可完成对MEV的快速检测。本发明根据PCR技术原理，根据MEV的特点，建立了检测MEV的双重PCR检测方法，其简单、快速、特异性好、灵敏度高，可以用于MEV的快速检测。
【IPC分类】C12N15-11, C12R1-93, C12Q1-70, C12Q1-68
【公开号】CN104726616
【申请号】CN201510172812
【发明人】谢之景, 姜常青
【申请人】山东农业大学
【公开日】2015年6月24日
【申请日】2015年4月14日