用于产生棒麦角素型生物碱的基因和方法
【专利说明】
[0001] 本申请要求 US 61/691848、EP 12181388. 5、US 61/786841、EP13159444. 2 和 EP 13178008. 2号申请的优先权，所述文献均通过引用的方式完整并入。
技术领域
[0002] 本发明原则上涉及重组产生棒麦角素型生物碱（clavine-type alkaloids)如环 棒麦角素（cycloclavine)、狐茅麦角碱（festuclavine)、田麦角碱（agroclavine)、裸麦角 碱（chanoclavine)和裸麦角碱醛（chanoclavine aldehyde)的领域。本发明提供用于产 生棒麦角素型生物碱的微生物和方法、以及可以在产生棒麦角素型生物碱的方法中使用的 多肽、多核苷酸和包含这类多核苷酸的载体。
【背景技术】
[0003] 麦角类生物碱（ergot alkaloids)属于具有多样性结构和生物活性的Π 引噪衍 生物复杂家族（Flieger 1997，Folia Microbiol (Praha) 42:3 - 30 ;Schardl2006, Chem Biol 63:45 - 86)，由以下科的真菌产生：麦角科（Clavicipitaceae)(例如麦角菌属 (Claviceps)和 Neotyphodium 或香柱菌属（Epichloee))和发菌科（Trichocomaceae) (包括曲霉属（Aspergillus)和青霉属（Penicillium))。重要的天然生产者是麦角菌 属、青霉属和曲霉属真菌（Flieger 1997,见上述引文；Schradl，见上述引文），但是它 们还存在于蜜孢霉属（Sphacelia)、瘤座菌属（Balansia)或Periglandula中（Pai outovdi，S·等人，2008, Fungal Diversity，31:95_110 和 Steiner，U.2011，Mycolog ia，103 (5) : 1133-1145)。天然麦角类生物碱及其半合成性衍生物广泛应用于现代医学中并 且显示出广谱药理学活性，包括子宫收缩活性、调节血压、控制垂体激素分泌、预防偏头痛 和多巴胺能活性及神经安定活性（de Grootl998，Drugs 56:523 - 535 ;Haarmann 2009, Mol Plant Pathol 10:563 - 577 ;Schardl2006,见上述引文）。麦角类生物碱可以根据它们的 结构特征分成两类，即，D-麦角酸的酰胺衍生物和棒麦角素型生物碱（Flieger 1997,见 上述引文；Griiger 1998，Alkaloids Chem Biol 50:171-218)。第一组的成员通常由 麦角酸和肽结构部分组成。它们又称作麦角肽碱（ergopeptine)。麦角肽碱的重要成员 例如是麦角胺（ergotamine)和麦角缴碱（ergovaline)。棒麦角素型生物碱，如环棒麦角 素、田麦角碱、烟曲麦角碱（fumigaclavine)和相似物质如野麦角碱（elymoclavine)、焦 棒麦角碱（pyroclavine)、肋麦角碱（costaclavine)或epcostaclavine以及其前体裸麦 角碱-I和裸麦角碱醛，仅由相同或相似的三环系统或四环系统组成，类似麦角肽碱，但是 缺少肽结构部分。但是，棒麦角素型生物碱也可以包含额外的取代基并因此不限于上文提 到的棒麦角素型生物碱。这类衍生物的例子是烟曲麦角碱类，如烟曲麦角碱A、B或C、异 烟曲麦角碱A或B、或者9-脱乙酰烟曲麦角碱C(Wallwey，C. *Li，S.M.2011，Nat.Prod. R印.，28:496-510))，其与狐茅麦角碱共有基本结构，但是包含额外的取代基。烟曲麦角碱 类例如可以由青霉和曲霉例如烟曲霉产生（A.fumigatus) (Flieger 1997,见上述引文）。 而麦角科真菌例如麦角菌（C. purpurea) (Flieger 1997,见上述引文）具有产生麦角肽碱 的能力，所述麦角肽碱可以被认为是麦角酸的衍生物，所述衍生物的前体之一是棒麦角素 型生物碱田麦角碱。比较ergopeptidens和棒麦角素型生物碱的前体，表明它们的生物 合成途径早期阶段非常相似并且可能例如是烟曲霉和麦角菌共有的，而该途径中稍后步 骤在这两个真菌物种中不同（Li 2006, Chembiochem 7:158 - 164 ;Panaccione 2005, FEMS Microbiol Lett 251:9-17 ;Schardl2006,见上述引文）。
[0004] 发酵生产棒麦角素型生物碱和甚至麦角类生物碱通常必须解决麦角类生物碱天 然产生者倾向于难以大规模培养的问题。这个问题的一个原因是以深层培养法发酵丝状 真菌的技术问题。一些天然麦角类生物碱生产者甚至是植物属如番薯属（Ipomoea)，里韦 亚属（Turbina)、银背藤属（Argyreia)和腺叶藤属（Strictocardia)(例如 Periglandula 物种）的内寄生菌或某些草本植物物种如黑麦草属（Lolium)、高粱属（Sorghum)或羊茅属 (Festuca)的内寄生菌（例如Neotyphodium和香柱菌属（Epichloe)物种）。另外，许多天 然麦角类生物碱生产者仅在特定条件或在某些发育阶段期间产生这些生物碱，并且甚至那 时它们也通常以低生产率生产。许多天然麦角类生物碱生产者产生一组不同的麦角类生物 碱，这造成以成本有效方式分离给定生物碱的问题并且甚至进一步降低特定目的生物碱的 产量。
[0005] 全化学合成麦角类生物碱或甚至复杂度较低的棒麦角素型生物碱迄今仍然代表 一项巨大挑战：并且通常导致外消旋混合物的合成。
[0006] 为了克服这些问题，本发明提供重组微生物和重组天然麦角类生物碱生产生物、 以及多核苷酸、多肽、载体、和使用这些重组微生物和重组天然麦角类生物碱生产生物、多 核苷酸、多肽和载体用于生产棒麦角素型生物碱的方法。
[0007] 发明概述
[0008] 本发明提供重组微生物，所述重组微生物包含：
[0009] a)至少一种EasH活性，或
[0010] b)至少一种EasH和EasD活性，或
[0011] c)至少一种EasH和EasA还原酶活性，或
[0012] d)至少一种 EasH、EasD 和 EasA 活性，或
[0013] e)至少一种EasH和EasD、EasA还原酶和EasG活性，或
[0014] f)至少一种 DmaW、EasF、EasE、EasC、EasD、EasH、EasA 和 EasG 活性，或
[0015] g)至少一种 EasD、EasA 和 EasG 活性，或
[0016] h)至少一种 DmaW、EasF、EasE、EasC、EasD、EasA 还原酶和 EasG 活性，或
[0017] i)至少一种 DmaW、EasF、EasE、EasC、EasD、EasA 异构酶和 EasG 活性，或
[0018] j)至少一种 DmaW、EasF、EasE 和 EasC 活性，
[0019] k)a)至j)中至少两者的组合，
[0020] 其中所述重组微生物不是天然麦角类生物碱生产生物。
[0021] 本发明还提供重组天然麦角类生物碱生产生物，所述生物具有至少一种上调的选 自以下的活性：DmaW、EasF、EasE、EasC、EasD、EasH、EasA 和 EasG 活性，其中 EasA 活性是 EasA还原酶、EasA异构酶、或EasA还原酶和EasA异构酶活性。
[0022] 重组天然麦角类生物碱生产生物包含至少一种上调的活性，所述上调的活性为选 自以下的一个或多个组的活性：
[0023] a)至少一种EasH活性，或
[0024] b)至少一种 EasH 和 EasD，或
[0025] c)至少一种EasH和EasA还原酶活性，或
[0026] d)至少一种 EasH、EasD 和 EasA 活性，或
[0027] e)至少一种EasH和EasD、EasA还原酶和EasG活性，或
[0028] f)至少一种 DmaW、EasF、EasE、EasC、EasD、EasH、EasA 和 EasG 活性，或
[0029] g)至少一种 EasD、EasA 和 EasG 活性，或
[0030] h)至少一种 DmaW、EasF、EasE、EasC、EasD、EasA 还原酶和 EasG 活性，或
[0031] i)至少一种 DmaW、EasF、EasE、EasC、EasD、EasA 异构酶和 EasG 活性，或
[0032] j)至少一种 DmaW、EasF、EasE 和 EasC 活性。
[0033] 本发明还提供如上所述的重组天然麦角类生物碱生产生物，所述生物具有至少一 种下调的选自EasD、EasH、EasA还原酶、EasA异构酶和EasG活性的活性D本发明的另一 个实施方案是如本文中所述的重组微生物或重组天然麦角类生物碱生产生物，所述生物包 含增大的DMPP供应量和/或增大的Me-DMT供应量，优选地包含至少一种下调的ERG9或 ERG20活性，或至少一种上调的HMG-CoA还原酶活性，或包含至少一种下调的ERG9或ERG20 活性和至少一种上调的HMG-CoA还原酶活性。
[0034] 其他本发明的实施方案包含如上文所述的重组微生物或重组天然麦角类生物碱 生产生物，所述生物包含至少一个重组多核苷酸，所述重组多核苷酸编码：
[0035] a)至少一种EasH活性，或
[0036] b)至少一种EasH和EasD活性，或
[0037] c)至少一种EasA还原酶或至少一种EasA异构酶活性，或
[0038] d)至少一种EasD、EasA异构酶和EasG活性，或
[0039] e)至少一种EasD、EasA还原酶和EasG活性，或
[0040] f)至少一种EasH、EasD、EasA还原酶、EasA异构酶和EasG活性，或
[0041] g)至少一种EasH、EasD、EasA还原酶和EasG活性，或
[0042] h)至少一种EasH、EasD、EasA异构酶和EasG活性，或
[0043] i)至少一种 DmaW、EasF、EasE 和 EasC 活性，
[0044] j)a)至i)中至少两者的组合。
[0045] 本发明也提供重组多核苷酸，所述重组多核苷酸编码：
[0046] a)至少一种EasH活性，或
[0047] b)至少一种EasH和EasD活性，或
[0048] c)至少一种EasA还原酶或至少一种EasA异构酶活性，或
[0049] d)至少一种EasD、EasA异构酶和EasG活性，或
[0050] e)至少一种EasD、EasA还原酶和EasG活性，或
[0051] f)至少一种EasH、EasD、EasA还原酶、EasA异构酶和EasG活性，或
[0052] g)至少一种EasH、EasD、EasA还原酶和EasG活性，或
[0053] h)至少一种EasH、EasD、EasA异构酶和EasG活性，或
[0054] i)至少一种 DmaW、EasF、EasE 和 EasC 活性，
[0055] j)a)至i)中至少两者的组合。
[0056] 本发明还提供如上文所述的重组微生物或重组天然麦角类生物碱生产生物、或如 所述的重组多核苷酸，其中DmaW活性归因于
[0057] a)包含与SEQ ID NO: 145和146具有至少90%序列同一性的氨基酸序列的多肽， 或
[0058] b)包含与SEQ ID NO: 147或190具有至少90%序列同一性的氨基酸序列的多肽， 或
[0059] c)包含与SEQ ID N0:l、19、20、179或180具有至少40%序列同一性的氨基酸序 列的多肽，或
[0060] d)包含与 SEQ ID 勵：1、19、20、21、22、23、24、25、26、27或28具有至少90%序列 同一性的氨基酸序列的多肽，或
[0061] e)由与SEQ ID NO: 102、122或123具有至少70%序列同一性的多核苷酸编码的 多肽，或
[0062] f)由与SEQ ID NO: 129或137具有至少70%序列同一性的多核苷酸编码的多肽， 或
[0063] g)可以通过使用两种PCR引物获得的多核苷酸编码的多肽，每种引物各包含选自 SEQ ID NO: 102、122或123所述序列的多核苷酸序列的至少15个连续核苷酸，或
[0064] h)由以下多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸在严格条件下与SEQ ID NO: 102、 122或123杂交，或
[0065] i)根据a)至h)中至少两者、优选地根据至少b)和c)的多肽，或
[0066] 根据a)至i)中至少之一的多肽，所述多肽可以从天然麦角类生物碱生产生物获 得。
[0067] 其他实施方案包含如本文所述的重组微生物或重组天然麦角类生物碱生产生物、 或如上文所述的重组多核苷酸，其中EasF活性归因于
[0068] a)包含与SEQ ID NO: 154具有至少90%序列同一性的氨基酸序列的多肽，或
[0069] b)包含与SEQ ID N0:6、75或76具有至少40%序列同一性的氨基酸序列的多肽， 或
[0070] c)包含与 SEQ ID 勵:6、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84或85具有至少90%序 列同一性的氨基酸序列的多肽，或
[0071] d)由与SEQ ID NO: 107或120具有至少70%序列同一性的多核苷酸编码的多肽， 或
[0072] e)由与SEQ ID NO: 134或142具有至少70%序列同一性的多核苷酸编码的多肽， 或
[0073] f)由用两种PCR引物可获得的多核苷酸编码的多肽，每种引物各包含下述多核苷 酸序列的至少15个连续核苷酸，所述多核苷酸序列选自SEQ ID NO: 107或120描述的序列， 或
[0074] g)由以下多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸在严格条件下与SEQ ID NO: 107或 120杂交，或
[0075] h)根据a)至g)中至少两者、优选地根据至少a)和b)的多肽，或
[0076] i)根据a)至h)中至少之一的多肽，所述多肽可从天然麦角类生物碱生产生物获 得。
[0077] 本发明的其他部分包括如上文所述的重组微生物或重组天然麦角类生物碱生产 生物、或如上文所述的重组多核苷酸，其中EasE活性归因于
[0078] a)包含与SEQ ID NO: 153、185或191具有至少90%序列同一性、优选地与SEQ ID NO: 191具有至少90%序列同一性的氨基酸序列的多肽，或
[0079] b)包含与SEQ ID N0:5或64具有至少40%序列同一性的氨基酸序列的多肽，或
[0080] c)包含与 S