重组细胞以及β-水芹烯的生产方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种具有0 -水芹烯生产能力的重组细胞及使用该重组细胞的0 -水 芹烯的生产方法。
【背景技术】
[0002] 单萜为以栊牛儿基二磷酸（GPP)为生物合成前体的符合具有10个碳的异戊二烯 规则的化合物的总称，所述栊牛儿基二磷酸为二甲基烯丙基二磷酸（DMAPP)和异戊烯基二 磷酸（IPP)缩合而成。单萜目前已知有900种以上。
[0003] 单萜具有如玫瑰及柑橘类之类的芳香，也多用于香水等。例如柠檬烯为柠檬等柑 橘类中所含的香气成分，也用作溶剂及粘接剂原料等。另外，薄荷醇具有清爽的芳香，可 在点心及医药品中用作清凉剂。另一方面，在树脂产业中，将蒎烯、a-蒎烯、柠檬烯、 a_水芹烯等作为粘接剂及透明树脂等单体原料进行研宄（非专利文献1)
[0004] 单猫之一的0 _水序稀（0-phellandrene)可期待作为新的聚合物材料的用途。 0 _水芹烯与a_水芹烯相比能够得到分子量更高的聚合物。但是，在通过合成化学的方法 得到水芹烯的情况下，无法避免其异构体即水芹烯的生成，另外，这些异构体的分 离非常困难（非专利文献2)。因此，难以得到高纯度的水芹烯，这就难以调查水芹 烯的聚合物物性等。
[0005] 另一方面，作为0_水芹烯的生物合成路径，可通过栊牛儿基二磷酸（GPP)合成酶 或橙花基二磷酸（NPP)合成酶的作用，由异戊烯基二磷酸（IPP)对栊牛儿基二磷酸（GPP) 或橙花基二磷酸（NPP)进行生物合成。接着，可通过水芹烯合成酶的作用由GPP或NPP 对水芹烯进行生物合成。而且，在西红柿和薰衣草中，发现了 水芹烯合成酶（非专 利文献3、4)。
[0006] 在专利文献1中记载有一种使用导入了对环状猫合成酶（Cyclicterpene synthase)进行编码的核酸的Cl代谢宿主细胞的转化体制造单猫的方法。作为其实施例， 记载有一种使用甲基单胞菌属细菌的转化体制造柠檬烯的实验例。但是，关于水芹烯 虽然有提到，但未示出实施例。有提到水芹烯合成酶，但未示出水芹烯合成酶和其 基因的具体例及获得方法以及可生产0 _水芹烯的转化体的具体构成及构建方法。
[0007] 现有技术文献
[0008] 专利文献
[0009] 专利文献1 :日本特表2005-500805号公报
[0010] 非专利文献
[0011] 非专利文献 1:SatouK.，etal.，GreenChemistry2006, 8, 878-882
[0012] 非专利文献 2:MoriK.，Tetrahedron:Asymmetry2006, 17, 2133-2142
[0013] 非专利文献 3:Demissie,Z.A.，etal.，，Planta.2011，233, 685-96.
[0014]非专利文献4 :Schilmiller，A.L.，etal.，ProcNatlAcadSciUS A.,2009,106,10865-70.
【发明内容】
[0015] 发明所要解决的问题
[0016] 鉴于上述现状，本发明的目的在于，提供一种用于高纯度且大量地获得水芹 烯的一系列的技术。
[0017] 用于解决问题的技术方案
[0018] 用于解决上述的问题的本发明的一个方面为一种具有水芹烯生产能力的重 组细胞，其将选自编码栊牛儿基二磷酸合成酶的核酸及编码橙花基二磷酸合成酶的核酸中 的至少1种核酸和编码水芹烯合成酶的核酸导入宿主细胞而成，且这些核酸在宿主细 胞内表达。。
[0019] 本发明涉及一种具有水芹烯生产能力的重组细胞。本发明的重组细胞是将 "选自编码栊牛儿基二磷酸（GPP)合成酶的核酸及编码橙花基二磷酸（NPP)合成酶的核酸 中的至少1种核酸"和"编码0 _水芹烯合成酶的核酸"导入宿主细胞而成的，且这些核酸 在宿主细胞内表达。即，在本发明的重组细胞中，相对于宿主细胞新添加或增强了GPP合成 酶和/或NPP合成酶的表达能力和0-水芹烯合成酶的表达能力。
[0020] 在本发明的重组细胞中，可基于细胞内所表达的GPP合成酶的作用由异戊烯基二 磷酸（IPP)合成GPP，和/或可基于细胞内所表达的NPP合成酶的作用由IPP合成NPP。并 且，可基于细胞内所表达的水芹烯合成酶的作用由GPP和/或NPP合成水芹烯。其 结果，可以通过培养本发明的重组细胞来高纯度且大量地生产水芹烯。
[0021] 优选宿主细胞不具有甲烷单加氧酶。
[0022] 优选宿主细胞为大肠杆菌或酵母。
[0023] 可以通过这种构成容易地大量培养重组细胞。
[0024] 优选重组细胞的湿润菌体lg可生产10mg以上的0 -水芹烯。
[0025]优选编码栊牛儿基二磷酸合成酶的核酸对下述（a)、（b)或（c)的蛋白质进行编 码。
[0026] (a)由序列号2所示的氨基酸序列构成的蛋白质、
[0027] (b)由在序列号2所示的氨基酸序列中缺失、置换或添加了 1~20个氨基酸而成 的氨基酸序列构成，且具有栊牛儿基二磷酸合成酶活性的蛋白质、
[0028] (c)具有与序列号2所示的氨基酸序列显示60%以上的同源性的氨基酸序列，且 具有栊牛儿基二磷酸合成酶活性的蛋白质。
[0029] 优选编码橙花基二磷酸合成酶的核酸对下述（d)、（e)或（f)的蛋白质进行编码。
[0030] (d)由序列号4所示的氨基酸序列构成的蛋白质、
[0031] (e)由在序列号4所示的氨基酸序列中缺失、置换或添加了 1~20个氨基酸而成 的氨基酸序列构成，且具有橙花基二磷酸合成酶活性的蛋白质、
[0032] (f)具有与序列号4所示的氨基酸序列显示60%以上的同源性的氨基酸序列，且 具有橙花基二磷酸合成酶活性的蛋白质。
[0033] 优选编码0 _水芹烯合成酶的核酸对下述（g)、（h)或（i)的蛋白质进行编码。
[0034] (g)由序列号6或8所示的氨基酸序列构成的蛋白质、
[0035] (h)由在序列号6或8所示的氨基酸序列中缺失、置换或添加了 1~20个氨基酸 而成的氨基酸序列构成，且具有0 -水芹烯合成酶活性的蛋白质、
[0036] (i)具有与序列号6或8所示的氨基酸序列显示60%以上的同源性的氨基酸序 列，且具有水芹烯合成酶的活性的蛋白质。
[0037] 优选还导入对在异戊烯基二磷酸的合成路径中发挥作用的至少1个酶进行编码 的核酸，该核酸在宿主细胞内表达。
[0038] 可通过这种构成有效地供给GPP合成酶及NPP合成酶的基质即IPP。
[0039] 优选异戊烯基二磷酸的合成路径为甲羟戊酸路径。
[0040] 优选所述甲羟戊酸路径为酵母或放线菌的甲羟戊酸路径。
[0041] 本发明的其它方面为一种水芹烯的生产方法，其包括：通过培养上述的重组 细胞使该重组细胞生产水芹稀。
[0042] 本发明涉及一种0-水芹烯的生产方法。在本发明中，通过培养上述的重组细胞 使该重组细胞生产水芹烯。根据本发明，可以高纯度且大量地生产水芹烯。
[0043] 优选使重组细胞的湿润菌体lg生产10mg以上的0 -水芹烯。
[0044] 优选对释放到重组细胞的细胞外的0 -水芹烯进行回收。
[0045] 优选从重组细胞的培养体系的气相中回收0-水芹烯。
[0046] 发明的效果
[0047] 根据本发明，可以高纯度且大量地生产水芹烯。
【附图说明】
[0048] 图1是表示用GC-MS对实施例5中进行的培养的气相分率进行分析的结果的总离 子色谱图，（a)为对照的重组体的情况，（b)为具有水芹烯生产能力的重组体的情况；
[0049] 图2是表示用GC-MS对图1 (b)的各峰进行鉴定的结果的质谱，（a)为峰A( 0-水 芹烯）的情况，（b)为峰B(柠檬烯）的情况，（c)为峰C(月桂烯）的情况。
【具体实施方式】
[0050] 本发明的重组细胞为将选自编码栊牛儿基二磷酸合成酶的核酸及编码橙花基二 磷酸合成酶的核酸中的至少1种核酸和编码0-水芹烯合成酶的核酸导入宿主细胞而成， 且这些核酸在宿主细胞内表达，并具有水芹烯合成能。
[0051] 作为GPP合成酶，只要为可在重组细胞内发挥其酶活性的酶就没有特别限定。关 于编码GPP合成酶的核酸（基因）也同样，只要为可在重组细胞内正常地转录、翻译的核酸 就没有特别限定。
[0052] 关于NPP合成酶、0-水芹烯合成酶及编码这些的核酸也同样。
[0053] 作为GPP合成酶的具体例，可以举出：源自于拟南芥（Arabidopsisthaliana) 的酶（基因银行注册编号：（GenBankAccessionNo.) :Y17376/At2g34630 ;Bouvier,F.，et al.，PlantJ, ? 2000, 24, 241-52.)、源自于结核菌（Mycobacteriumtuberculosis)的 酶（基因银行注册编号：（GenBankAccessionNo.) :NP_215504 ;Mann，F.M.，etal.，FEBS Lett.，2011，585, 549-54.)等。
[0054] 序列号1中示出与编码上述源自于拟南芥的GPP合成酶的核酸（DNA)的碱基序列 对应的氨基酸序列，序列号2中仅示出氨基酸序列。具有序列号1所示的碱基序列的DNA 为编码GPP合成酶的核酸的一个例子。
[0055] 并且，编码GPP合成酶的核酸中至少含有对下述（a)、（b)或（c)的蛋白质进行编 码的核酸。
[0056] (a)由序列号2所示的氨基酸序列构成的蛋白质、
[0057] (b)由在序列号2