一种重组蛋白及其在昆虫杆状病毒表达系统中的表达方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及基因工程领域，具体设及一种重组蛋白及其在昆虫杆状病毒表达系统 中的表达方法。
【背景技术】
[0002] 己型肝炎病毒化巧atitisBvirus,皿V)感染是全球尤其是我国疾病负担之一； 全世界超过2亿的人已经或正在感染己型肝炎病毒，它能够引起肝炎、肝硬化乃至肝细胞 肝癌化巧atocellularcarcinoma,肥C)。据统计，每年约有78万人死于己型肝炎及其引起 的相关疾病中，严重危害人类的健康，影响人们的生活质量。皿V全基因组可编码多种病毒 蛋白，深入探讨各种病毒蛋白的生物学功能对皿V感染相关疾病的发生机制的揭示和临床 检测治疗的指导具有非常重要的意义。
[0003] 目前，上市的己肝疫苗大多数是皿V的表面抗原即S蛋白，但己肝病毒逃逸现象仍 然严重，相关研究表明己肝病毒C蛋白和e蛋白与己肝病毒逃逸现象的发生密切相关。己 肝病毒前C蛋白化巧atitisBvirusprecore,皿Vpre-c)是己型肝炎病毒C蛋白和e蛋 白的前体，生物学功能尚不十分明确。相关研究表明，皿Vpre-c蛋白与C蛋白结合形成的 复合物可能有利于病毒的持续感染W。
[0004] 设计疫苗的关键在于能够有效地活化抗原呈递细胞（antigenpresenting cell,APC)，促进抗原呈递和激活免疫反应。并且由于APC的表面能够表达化R(化 receptor)，所W抗原-化融合蛋白可W作为抗原的运载工具，借助化片段祀向作用结合 APC，从而缩短抗原在血液中的游离时间，减少蛋白酶对抗原的降解，因而能够提高抗原半 衰期，加强抗原的呈递。
[0005] 1983年由smith等建立了具有蛋白表达水平局、对目的蛋白有翻译后修饰、周 期短等优势的杆状病毒表达系统化a州lovirusexpressionvectorsystem,邸VS)。继 2007年第一个被美国食品药品监督管理局（抑A)批准上市的宫颈癌预防双价人乳头瘤病 毒疫苗Cerearix批准上市，2013年美国FDA批准预防18~49岁人群季节性流感的疫苗 FluBlok上市W来，杆状病毒表达系统现已广泛应用于疫苗的生产、生物制药和基因工程当 中。
【发明内容】
[0006] 针对W上发现，本发明运用杆状病毒表达系统表达己型肝炎病毒前C蛋白-小鼠 IgG化的融合蛋白作为疫苗，W获得具有免疫活性的重组蛋白，W大大减少己肝病毒逃逸 的问题，为慢性己型肝炎的免疫治疗的研究奠定基础并开拓新的思路。
[0007] 本发明的目的之一是提供一种皿Vpre-c-化蛋白，其能够大大减少己肝病毒逃逸 现象，且由于该蛋白融合小鼠IgGFc，能够缩短抗原在血液中的游离时间，减少蛋白酶对抗 原的降解，提高抗原半衰期，加强抗原的呈递。
[000引本发明的还有一个目的是提供一种重组杆状病毒，其能够成功表达皿Vpre-c-Fc 蛋白，并能够大规模生产皿V pre-c-Fc蛋白。
[0009] 为此，本发明提供的技术方案为：
[0010] 一种重组皿V pre-c-Fc蛋白质分子，其氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
[0011] 一种DM分子，其编码如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。
[001引一种重组载体，其含有所述的DNA分子和与所述DNA分子连接的用于表达的调节 序列。
[001引宿主细胞，所述宿主细胞含有所述的DNA分子。
[0014] 另一方面，提供了一种获得重组杆状病毒的方法，包括如下步骤：
[0015] 步骤一、对如SEQ ID NO: 1所示的多核巧酸序列进行密码子优化得到如SEQ ID NO: 2所示的核巧酸序列，之后通过人工合成如SEQ ID NO: 2所示的核巧酸序列并将其构建 到pUC57质粒上得到ptX57皿V pre-c-Fc重组载体；之后进入步骤二，
[0016] 步骤二、WpUC57皿Vpre-c-Fc重组载体为模板，利用如SEQIDN0:4和SEQID N0:5所示的引物序列通过PCR扩增得到如SEQIDN0:2所示的核巧酸序列的基因片段并将 其构建到pFas巧ac质粒上W得到pFas巧ac-HBVpre-c-Fc重组载体；之后进入步骤S，
[0017] 步骤S、利用步骤二得到的pFas1:Bac-HBV pre-c-Fc重组载体转座含有Bacmid质 粒的E. Coli畑lOBac感受态细胞中，从而使其发生同源重组W得到Bacmid-HBV pre-c-Fc 重组载体；之后进入步骤四，
[001引步骤四，利用Bacmid-HBVpre-c-Fc重组质粒转染昆虫细胞W得到第一代重组杆 状病毒。
[0019] 优选的是，所述的获得重组杆状病毒的方法，在所述步骤四之后还包括步骤五：
[0020] 将步骤四中得到的第一代重组杆状病毒转染昆虫细胞W表达得到第二代重组杆 状病毒，之后再利用同样的方法直到得到第四代重组杆状病毒。
[002U 优选的是，所述的获得重组杆状病毒的方法中，所述步骤四中，利用Bacmid-HBV pre-c-化重组质粒转染昆虫细胞W得到第一代重组杆状病毒的具体过程为：
[002引（4. 1)从含有Bacmid-HBVpre-c-Fc载体的EcoliD册a菌株中提取Bacmid-HBV pre-c-Fc质粒；
[002引（4.。取对数生长期的S巧细胞，加入到六孔板中，每孔8X105个；
[0024] (4. 3)静置30min使得S巧细胞贴于下壁；
[002引（4. 4)取8y1细胞转染试剂加入到100y1的昆虫细胞培养基中混匀，取1y1 Bacmid-HBVpre-c-化质粒加入到100 昆虫细胞培养基中混匀，然后将两种混合液混 合，即得到转染混合物；
[0026] (4. W将转染混合物滴加到细胞中，27°C解育3-5小时；
[0027] (4. 6)弃去转染混合物，加入2ml新的昆虫细胞培养基，27°C下培养72h;其中，所 述昆虫细胞为S巧细胞。
[002引在本发明的又一个方面，提供了一种重组杆状病毒，由如任一项所述的获得重组 杆状病毒的方法获得，该重组杆状病毒包含编码SEQ ID N0:3所示的氨基酸序列的核巧酸 序列。
[0029] 在本发明的再一个方面，还提供可一种生产重组皿V pre-c-化蛋白质的方法，包 括W下步骤：使用所述的重组杆状病毒感染昆虫细胞，分离纯化产生的重组皿V pre-c-Fc 蛋白。
[0030] 本发明还提供了所述重组杆状病毒在制备预防或治疗己型肝炎的疫苗或药物中 的应用。
[0031] 本发明的有益效果为：
[0032] 本发明成功在杆状病毒表达系统中表达了具有免疫原性的皿Vpre-c-化蛋白，纯 化后蛋白纯度达90%W上，蛋白产量约为3. 03mg/l，纯化蛋白能有效刺激BALB/c小鼠产生 特异抗体，为生产己肝治疗性疫苗奠定了基础。
【附图说明】
[0033] 图1显示了本发明的皿Vpre-c-化表达纯化W及生物活性测定的流程示意图；
[0034] 图2显示了本发明的pU巧7载体的质粒图谱；
[003引 图3显示了本发明的pFas巧ac?l的质粒图谱；
[0036]图4显示了PCR扩增皿Vpre-c-Fc基因跑胶图，图中 1;DNAMarkerDL2000, 2 ; 皿Vpre-c-Fc基因；
[0037]图 5 显示了pFas巧ac-HBVpre-c-Fc载体双酶切鉴定图，1;DNAMarkerDL2000， 2;BamHI和HindIII双酶切pFas巧ac-HBVpre-c-Fc载体；
[0038] 图6显示了PCR鉴定重组杆状病毒DM跑胶图，1;阴性对照，2;DNAMarkerDL 2000, 3,4;皿Vpre-c-Fc上下游引物及M13上下游引物分别交错进行PCR;
[0039]图7显示了正常及感染重组杆状病毒后的S巧细胞（100ym)，（a)为正常的Sf9 细胞，化）感染7化后的S巧细胞；
[0040] 图8显示了Western Blot检测不同时间表达蛋白表达情况
[004U图9显示了皿Vpre-c-Fc蛋白纯化结果，1 ;170邸预染蛋白标签170marker;2;总蛋白；3;穿出液；4-8是0. 1M甘氨酸-盐酸洗脱起峰后每1ml收集的样品。
[0042] 图10显示了小鼠血清中皿V核屯、蛋白抗体的Elisa检测。
【具体实施方式】
[0043] 本发明人发现，将己型肝炎病毒前C蛋白与小鼠IgG化融合，使该皿Vpre-c-Fc 蛋白能够被稳定表达，分泌到细胞周围或细胞内，能够通过简便的分离纯化步骤就可W方 便收集，为生产己肝治疗性疫苗奠定了基础。
[0044] 重组病毒的制备可W通过本领域的各种一致的途径制备。本发明优选了Bac-Bac 系统，利用可在大肠杆菌和昆虫细胞之间穿梭的载体Bacmid，将皿Vpre-c-Fc蛋白的序列 转化杆状病毒，从而能够在昆虫细胞中高度表达皿Vpre-c-Fc蛋白。
[0045] 根据本发明，可采用本领域技能中的常规分子生物学、微生物学、细胞学和DNA重 组技术。如果出现于本文下来术语的定义如下。
[0046] "DNA分子"指脱氧核糖核巧酸（胸腺喀晚、胞喀晚、腺嚷岭或鸟嚷岭）的聚合形式， 是染色体主要组成成分，同时也是组成基因的材料。该一术语只指分子的一级和二级结构， 不限制其任何具体的S级形式。本术语包括特别是在线性DNA分子、病毒、染色体、质粒