中 国发现的双链DNA。该里讨论的结构，按照习惯上给出的只是DNA正义链的5'到3'方向的 序列。
[0047]"载体"是指能够转运与其连接的另一个核酸的核酸分子，一种类型的载体是"质 粒"，质粒是其他的DNA片段可与其连接的环状双链DNA环。另一类型的载体是病毒载体， 其可将其他的DNA片段连接至病毒基因组。某些载体整合至宿主细胞基因组中，并得W与 宿主基因组一起复制。并且，某些载体能指导与其可操作连接的基因的表达，一般使用的该 样的表达载体为质粒形式。在本发明中，可交互使用"质粒"和"载体"。
[0048]"重组载体"是指已连接了基因的表达载体。在本发明中，可交互使用"重组质粒" 和"重组载体"。
[0049] 本文中的术语"宿主"不仅包括原核生物，也包括真核生物如酵母、植物和动物细 胞。
[0化0] 本发明中的"反向互补"，指通过碱基配对原则关联的核巧酸序列。例如，序列 "5, -A-T-G-3'"与序列"5, -C-A-T-3'"反向互补。
[0051]引物，又名引子。是一小段单链DNA或RNA，作为DNA复制的起始点，在核酸合成反 应时，作为每个多核巧酸链进行延伸的出发点而起作用的多核巧酸链，在引物的3' -OH上， 核巧酸W二醋链形式进行合成，因此引物的3'-0H，必须是游离的。之所W需要引物是因为 在DNA合成中DNA聚合酶仅仅可W把新的核巧酸加到已有的DNA链上。引物是人工合成的 两段寡核巧酸序列，一个引物与感兴趣区域一端的一条DNA模板链互补，另一个引物与感 兴趣区域另一端的另一条DNA模板链互补。DNA上携带有编码蛋白质氨基酸信息的核巧酸 序列的链称为正义链，又称编码链。另一条链核巧酸序列与正义链互补，称为反义链。一般 将与正义链互补的一个引物成为上游引物，与反义链互补的一个引物称为下游引物。
[0化2] 密码子优化；在基因表达研究中，研究者比较注意选择合适的表达载体和宿主系 统，W及基因本身是否与载体和宿主系统为最佳匹配。基因的最佳化表达可W通过对基因 的重新设计和合成来实现，如消除稀有密码子而利用最佳化密码子，二级结构最小化，调整 GC含量等。
[0053] 下面结合附图和实施例对本发明做进一步的详细说明，W令本领域技术人员参照 说明书文字能够据W实施。
[0化4]如图1所示，本发明将目的基因皿Vpre-c-Fc连接到pFas巧acl载体，获得的P化stBacl-HBVpre-c-Fc质粒转化Ecoli畑lOBac感受态细胞，通过化7转座子将目的基 因转座到Bacmid中，得到Bacmid-HBVpre-c-Fc穿梭载体，脂质体包被后转染Sf9昆虫细 胞获得第一代（P1代）病毒，重复转染S巧细胞获得高滴度病毒。收集细胞上清超滤后通 过ProteinG亲和层析柱纯化得到目的蛋白皿Vpre-c-Fc。纯化的蛋白大腿内侧肌肉注射 免疫BALB/c小鼠并检测血清中己型肝炎病毒核屯、蛋白抗体产生量。
[0055] 本发明中的载体及菌种；含有皿V pre-c-化基因序列（昆虫密码子优化）的 pUC57载体由华大基因提供，P化stBacl载体、E coli DHlOBac菌种、E coli.D册a菌种均 由本申请人保存。
[0056]试剂；Ex-^Taq酶、限审ij性内切酶BamHI和HindIII、DNA Marker 2000/1000/15000、DNA连接试剂盒均购自TaKaRa宝生物工程（大连）有限公司。高纯质 粒小量制备试剂盒、琼脂糖凝胶dm回收试剂盒均购自BioTeke公司。BCA蛋白浓度测定试 剂盒购自Tansgene公司。PVDF膜购自BI0-RID公司。皿V核屯、蛋白单克隆抗体购自油cam 公司。辣根过氧化酶标记驴抗鼠抗体购自Santa化UZ公司。CellfectinIIReagent购 自Invitrogen公司。S巧00IISFM1X、S巧细胞均购自Gibco公司。引物由深圳华大基 因科技有限公司合成。
[0化7] 实施例1
[005引 1.本发明的己型肝炎病毒前C蛋白的基因序列和小鼠IgG化蛋白的基因序列均 来自于NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)，将己型肝炎病毒前C蛋白的基因序列和小 鼠IgG化蛋白的基因序列直接组合，但是小鼠的IgG化基因序列中也包括它前面的连接 蛋白序列的，整体没有改变序列，得到如SEQIDNO: 1所示的多核巧酸序列，然后对SEQID NO: 1进行密码子优化，得到如SEQIDNO: 2所示的多核巧酸序列，密码子网址http://WWW. kazusa.or.jp/codon/cgi-bin/showcodon.cgi?species= 10455 ;W便于该序列在昆虫 细胞中表达。本发明的密码子优化是由华大基因公司直接优化，再全合成。具体优化密码 子表如下
[0059]SpodopterafrugiperdaMNPV[gbvrl]:151CDS'S(43395codons)
[0060]fields:[triplet][frequency:perthousand]([number])
[0061]
【主权项】
1. 一种重组HBV pre-c-Fc蛋白质分子，其氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
2. -种DNA分子，其编码如SEQ ID NO: 3所示的氨基酸序列。
3. -种重组载体，其特征在于，其含有权利要求2所述的DNA分子和与所述DNA分子连 接的用于表达的调节序列。
4. 宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有权利要求2所述的DNA分子。
5. -种获得重组杆状病毒的方法，其特征在于，包括如下步骤： 步骤一、对如SEQ ID NO: 1所示的多核苷酸序列进行密码子优化得到如SEQ ID NO:2所 示的核苷酸序列，之后通过人工合成如SEQ ID NO: 2所示的核苷酸序列并将其构建到pUC57 质粒上得到PUC57HBV pre-c-Fc重组载体；之后进入步骤二， 步骤二、以pUC57HBVpre-c-Fc重组载体为模板，利用如SEQIDN0:4和SEQIDN0:5 所示的引物序列通过PCR扩增得到如SEQ ID N0:2所示的核苷酸序列的基因片段并将其构 建到pFastBac质粒上以得到pFastBac-HBV pre-c-Fc重组载体；之后进入步骤三， 步骤三、利用步骤二得到的pFastBac-HBV pre-c-Fc重组载体转座含有Bacmid质粒的 E. Coli DHlOBac感受态细胞中，从而使其发生同源重组以得到Bacmid-HBV pre-c-Fc重组 载体；之后进入步骤四， 步骤四，利用Bacmid-HBV pre-c-Fc重组质粒转染昆虫细胞以得到第一代重组杆状病 毒。
6. 如权利要求5所述的获得重组杆状病毒的方法，其特征在于，在所述步骤四之后还 包括步骤五： 将步骤四中得到的第一代重组杆状病毒转染昆虫细胞以表达得到第二代重组杆状病 毒，之后再利用同样的方法直到得到第四代重组杆状病毒。
7. 如权利要求5所述的获得重组杆状病毒的方法，其特征在于，所述步骤四中，利用 Bacmid-HBV pre-c-Fc重组质粒转染昆虫细胞以得到第一代重组杆状病毒的具体过程为： (4.1)从含有 Bacmid-HBV pre-c-Fc 载体的 E coli DH5a 菌株中提取 Bacmid-HBV pre-c-Fc 质粒； (4. 2)取对数生长期的Sf9细胞，加入到六孔板中，每孔8 X IO5个； (4. 3)静置30min使得Sf9细胞贴于下壁； (4. 4)取8μ1细胞转染试剂加入到100μΙ的昆虫细胞培养基中混勾，取ΙμL Bacmid-HBV pre-c-Fc质粒加入到100 μ 1昆虫细胞培养基中混匀，然后将两种混合液混 合，即得到转染混合物； (4. 5)将转染混合物滴加到细胞中，27°C孵育3-5小时； (4. 6)弃去转染混合物，加入2ml新的昆虫细胞培养基，27 °C 下培养72h ;其中，所述昆虫细胞为Sf9细胞。
8. -种重组杆状病毒，其特征在于，由如权利要求5至7任一项所述的方法获得。
9. 一种生产重组HBV pre-c-Fc蛋白质的方法，其特征在于，包括以下步骤：使用权利 要求8所述的重组杆状病毒感染昆虫细胞，分离纯化产生的重组HBV pre-c-Fc蛋白。
10. 权利要求8所述重组杆状病毒在制备预防或治疗乙型肝炎的疫苗或药物中的应 用。
【专利摘要】本发明公开了一种HBV pre-c-Fc重组蛋白及其编码核苷酸序列，并公开了含有该蛋白的编码序列的重组载体和宿主细胞，本发明还公开了一种重组杆状病毒和获得重组杆状病毒的方法及在昆虫杆状病毒表达系统中表达该HBV pre-c-Fc重组蛋白的方法，还公开了含有HBV pre-c-Fc编码基因的重组杆状病毒及HBV pre-c-Fc重组蛋白在制备预防或治疗乙型肝炎的疫苗或药物中的应用。通过本发明的方法得到的HBV pre-c-Fc重组蛋白注射免疫BALB/c小鼠，检测发现小鼠血清中乙型肝炎病毒核心蛋白抗体产生量远高于传统方法上用于制备乙肝疫苗的抗原。
【IPC分类】C12N15-62, A61P31-20, C12N15-866, A61K39-29, C07K19-00, A61K47-48
【公开号】CN104829732
【申请号】CN201510134312
【发明人】姜潮, 李校堃, 马吉胜, 田海山, 刘敏, 王海军, 王晓艳, 宋娜
【申请人】温州医科大学
【公开日】2015年8月12日
【申请日】2015年3月25日