液相芯片miRNA检测试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种液相芯片miRNA检测试剂盒。
【背景技术】
[0002] 肺癌是目前全球头号癌症杀手，其发病率和死亡率呈逐年迅速上升趋势，而中国 是世界上肺癌患者最多的国家。肺癌可分为NSCLC(非小细胞肺癌）和SCLC(Small cell lung cancer，小细胞肺癌），其中NSCLC约占肺癌总数的80%，并可大致分为SCC (Squamous cell carcinoma，鱗状细胞癌）、AC(Adenocarcinoma，腺癌）和LCC(Large cell carcinoma? 大细胞癌）。IV期NSCLC的5年生存率仅为10%，但I期NSCLC的5年生存率则可达到80% 左右，因此，如何对肺癌进行早期诊断成为了关键。目前，临床上使用肿瘤标志物进行体检， 由于一种肿瘤标志物可以出现在多种肿瘤中，一种肿瘤也可以出现多种肿瘤标志物，因此， 肿瘤标志物只能作为辅助检查项目。
[0003] microRNA(miRNA)是一类内源性非编码的小分子RNA，它们调节的基因超过半数 位于肿瘤相关基因组区或脆性位点，一旦发生失常就会影响肿瘤的发生及发展，miRNAs在 不同组织器官、不同病理类型及不同发病阶段的肿瘤中的表达具有特征性。大量研宄结果 表明，肺癌患者的癌组织、外周血、胸腔积液及痰液中均存在特异性表达的miRNAs，多达几 十种miRNAs被证实与肺癌有关，但不同实验组之间结果不尽相同且可比性较差，这主要是 由于miRNA的长度（small size)限制了其检测技术的发展，造成各课题组检测技术不同， 内参也不同。常用的miRNA检测方法包括northern blot、RT-qPCR和microarray。northern blot是金标准，但操作起来费时费力；RT-qPCR虽灵敏度较高，但茎环引物设计复杂，且无 法实现多重检测；microarray是高通量检测方法，但特异性和重复性较低，且价格昂贵，不 适用于临床。另外，不同公司的芯片和RT-qPCR试剂盒在设计原理上存在不少差异，导致相 互之间结果差异较大。
[0004] 液相芯片技术具有高通量、操作简便、不需要预处理和扩增的优点，且不同于固 相芯片，它指标选择灵活，可根据需要自行组合，大大降低检测成本。Dacic S et al使用 第一代FlexmiR对肺腺癌组织及癌旁组织中319种成熟miRNAs进行检测，发现miR-20a、 miR-328、miR-34c和miR-18b在癌组织中表达比癌旁组织增高20倍以上，同时miR-32、 miR-137和miR-342表达降低20倍以上。Markou A et al也使用同样的方法分析非小 细胞肺癌（NSCLC)癌组织和癌旁组织中miRNAs表达谱，不同的是，癌组织中仅miR-21表 达上调。Wang Y et al使用第二代FlexmiR选择性地检测了 NSCLC癌组织和癌旁组织中 的miR-21、miR-31、miR-222、miR-145和miR-126表达，发现癌组织中前三者表达增高，后 二者表达降低。用qRT-PCR对以上结果进行验证，两种技术检测结果呈高度相关，证实了 FlexmiR的可靠性。
【发明内容】
[0005] 本发明的一个目的是提供检测miR-21、miR-210和miR-31表达量的液相芯片 miRNA检测试剂和/或仪器的用途。
[0006] 本发明提供了 miR-21、miR-210和miR-31表达量的液相芯片miRNA检测试剂和/ 或仪器在制备鉴定或辅助鉴定待测样本是否为NSCLC癌组织的产品中的应用。
[0007] 本发明另一个目的是提供检测miR-21、miR-210和miR-31表达量的液相芯片 miRNA检测试剂和/或仪器的用途。
[0008] 本发明提供了检测miR-21、miR-210和miR-31表达量的液相芯片miRNA检测试剂 和/或仪器在制备鉴定或辅助鉴定待测患者是否为NSCLC患者的产品中的应用。
[0009] 本发明第三个目的是提供检测miR-21、miR-210和miR-31表达量的液相芯片 miRNA检测试剂和/或仪器的用途。
[0010] 本发明提供了检测miR-21、miR-210和miR-31表达量的液相芯片miRNA检测试剂 和/或仪器在制备诊断或辅助诊断待测患者是否为NSCLC患者的产品中的应用。
[0011] 本发明第四个目的是提供检测miR-21、miR-210和miR-31表达量的液相芯片 miRNA检测试剂和/或仪器的用途。
[0012] 本发明提供了检测miR-21、miR-210和miR-31表达量的液相芯片miRNA检测试剂 和/或仪器在制备预测或辅助预测待测人或动物是否会患有NSCLC的产品中的应用。
[0013] 本发明第五个目的是提供检测miR-21、miR-210和miR-31表达量的液相芯片 miRNA检测试剂和/或仪器的用途。
[0014] 本发明提供了检测miR-21、miR-210和miR-31表达量的液相芯片miRNA检测试剂 和/或仪器在制备预测或辅助预测待测患者是否会发生NSCLC复发的产品中的应用。
[0015] 上述应用中，
[0016] 所述检测miR-21、miR-210和miR-31表达量的液相芯片miRNA检测试剂和/或仪 器为检测miR-21、miR-210和miR-31表达量的液相芯片miRNA检测试剂盒；
[0017] 所述试剂盒包括miR-21嵌合探针、miR-210嵌合探针、miR-31嵌合探针、固定有探 针A的聚苯乙烯微球、固定有探针B的聚苯乙烯微球、固定有探针C的聚苯乙烯微球；
[0018] 所述探针A能结合所述miR-21嵌合探针；
[0019] 所述探针B能结合所述miR-210嵌合探针；
[0020] 所述探针C能结合所述miR-31嵌合探针；
[0021] 所述miR-21嵌合探针的核苷酸序列为序列表中序列1 ;
[0022] 所述miR-210嵌合探针的核苷酸序列为序列表中序列2 ;
[0023] 所述miR-31嵌合探针的核苷酸序列为序列表中序列3 ;
[0024] 所述探针A的核苷酸序列为序列4 ;
[0025] 所述探针B的核苷酸序列为序列5 ;
[0026] 所述探针C的核苷酸序列为序列6。
[0027] 上述应用中，
[0028] 所述各嵌合探针5'端均标记荧光基团生物素；
[0029] 所述试剂盒还包括荧光标记物SAPE、miR-21、miR-210和miR-31 ;
[0030] 所述miR-21的核苷酸序列为序列7 ;
[0031] 所述miR-210的核苷酸序列为序列8 ;
[0032] 所述miR-31的核苷酸序列为序列9。
[0033] 本发明第六个目的是提供检测miR-21、miR-210和miR-31表达量的液相芯片 miRNA检测试剂盒。
[0034] 本发明提供的试剂盒，为如下1)或2):
[0035] 1)鉴定或辅助鉴定待测样本是否为NSCLC癌组织的产品；
[0036] 2)鉴定或辅助鉴定待测患者是否为NSCLC患者的产品。
[0037] 上述的试剂盒中，所述试剂盒包括miR-21嵌合探针、miR-210嵌合探针、miR-31嵌 合探针、固定有探针A的聚苯乙烯微球、固定有探针B的聚苯乙烯微球、固定有探针C的聚 苯乙稀微球；
[0038] 所述探针A能结合所述miR-21嵌合探针；
[0039] 所述探针B能结合所述miR-210嵌合探针；
[0040] 所述探针C能结合所述miR-31嵌合探针；
[0041] 所述miR-21嵌合探针的核苷酸序列为序列表中序列1 ;
[0042] 所述miR-210嵌合探针的核苷酸序列为序列表中序列2 ;
[0043] 所述miR-31嵌合探针的核苷酸序列为序列表中序列3 ;
[0044] 所述探针A的核苷酸序列为序列4 ;
[0045] 所述探针B的核苷酸序列为序列5 ;
[0046] 所述探针C的核苷酸序列为序列6 ;
[0047] 所述各嵌合探针5'端均标记荧光基团生物素。
[0048] 上述的试剂盒中，所述试剂盒还包括荧光标记物SAPE、miR-21、miR-210和 miR-31 ；
[0049] 所述miR-21的核苷酸序列为序列7 ;
[0050] 所述miR-210的核苷酸序列为序列8 ;
[0051] 所述miR-31的核苷酸序列为序列9。
[0052] 上述试剂盒还包括液相芯片检测仪Luminex 200机器。
[0053] 所述试剂盒还包括记载如下标准的可读载体：若所述待测样本的RNA中miR-21 的表达量大于1478. 3amol/ μ 1，且miR-210的表达量大于2. 49amol/ μ 1，且miR-31的表 达量大于2. 57amol/ μ 1，则所述待测样本为或候选为NSCLC癌组织；若所述待测样本RNA 中miR-21、miR-210和miR-31的表达量不满足上述标准，则所述待测样本不为或候选不为 NSCLC癌组织。
[0054] 本发明的实验证明，对26例不同期NSCLC肺癌患者肿瘤组织miRNAs进行表达量 检测，发现miR-21、miR-210和miR-31