可以作为标志组合物，用于判断是否为NSCLC肺癌患 者，其预测准确率为88%。具有临床操作简便、高通量、可自由组合，绝对定量等特点，尤其 能够对NSCLC肺癌进行早期诊断，增加治愈的成功率。
【附图说明】
[0055] 图1为NSCLC癌组织和良性病变肺组织中miRNAs的表达（amol/ μ 1)，*Ρ〈(λ 05， **Ρ〈0. 01 ;
[0056] 图2为NSCLC癌组织与癌旁组织中miRNAs的表达（amol/ μ 1)。
[0057] 图3为ROC曲线。
[0058] 图4为检测的7个miRNA标准曲线。
【具体实施方式】
[0059] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0060] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0061] 实施例1、辅助检测NSCLC癌组织的标志物筛选及检测方法确定
[0062] 一、RNA 的提取
[0063] 1、研宄对象
[0064] 选取2013年6月-2014年3月期间深圳市人民医院胸外科经病理确诊，不同临床 分期、分型且术前未接受放疗和化疗的原发性NSCLC肺癌患者26例，取手术切除的肿瘤生 长活跃无坏死部位切除的癌组织Icm 3左右以及距离癌组织0. 5cm-2cm之间的癌旁组织Icm3 左右；非肺癌人群的组织标本来自肺部良性病变17例（包括肺大疱5例、炎性假瘤6例、肺 结核2例、错构瘤2例、硬化性血管瘤2例）的手术切除肺病变组织Icm 3左右。病理分型 由两位以上有经验的病理科专家一致诊断。入选的受检者均知情同意。
[0065] 2、试剂配制
[0066] (I)Rnase free CldH2O :9"ml CldH2O 中加入 Iml DEPC，搅拌混匀，室温下过夜后， 121°C 25min高压蒸汽灭菌，分装后4°C封闭保存。
[0067] (2) I. 5 X TMAC 杂交缓冲液：将 5M TMAC 225ml，20 % Sarkosyl solution I. 88ml， IM Tris-HCl (pH 8· 0) 18. 75ml，0· 5M EDTA (pH 8· 0)3. 0ml，Rnase free ddH20 I. 73ml 混匀 后室温保存。
[0068] (3)TE 缓冲液：1M，PH = 8. 0,5ml Tris-HCl Buffer，。· 5M，PH = 8· 0, Iml EDTA 向 烧杯中加入约400ml H20均匀混合；将溶液定容到500ml后，高温高压灭菌；室温保存。
[0069] (4) Rnase A酶切反应液：将Rnase A用3M NaCl按1:500稀释，分装后-20°C保 存。
[0070] 3、总RNA的提取
[0071] NSCLC肺癌患者癌组织、癌旁组织和非肺癌人群病变组织标本离体后IOmin内置 于液氮罐内迅速冷冻后转移至_70°C冰箱保存。使用时先称取重量，用液氮研磨法将组织磨 成粉末，按50~80mg/ml的分量加入RNAiso Plus，混匀后将混合液分装成Iml每管，提取 上述26例NSCLC患者癌组织RNA、26例NSCLC患者癌旁组织RNA和17例非肺癌人群病变 组织RNA。
[0072] 二、液相芯片miRNA检测
[0073] 1、探针设计及试剂的配置
[0074] 1)微球及其上探针序列和对应的嵌合探针序列
[0075] 购买7种聚苯乙烯微球MagPlex? -TAG?，7种MagPlex? -TAG?微球上的探针 序列见表1 ;根据筛选出的NSCLC特异性miRNAs的序列（利用miRBase数据库查询）和 MagPlex? -TAG?微球上anti-TAG的序列，设计嵌合探针。嵌合探针的RNA端与检测样本 miRNA的序列互补，嵌合探针的DNA端与对应微球探针互补，5'端标记生物素。
[0076] 表1为微球上探针序列和对应的嵌合探针序列
【主权项】
1. 检测miR-21、miR-210和miR-31表达量的液相芯片miRNA检测试剂和/或仪器在 制备鉴定或辅助鉴定待测样本是否为NSCLC癌组织的产品中的应用。
2. 检测miR-21、miR-210和miR-31表达量的液相芯片miRNA检测试剂和/或仪器在 制备鉴定或辅助鉴定待测患者是否为NSCLC患者的产品中的应用。
3. 检测miR-21、miR-210和miR-31表达量的液相芯片miRNA检测试剂和/或仪器在 制备诊断或辅助诊断待测患者是否为NSCLC患者的产品中的应用。
4. 检测miR-21、miR-210和miR-31表达量的液相芯片miRNA检测试剂和/或仪器在 制备预测或辅助预测待测人或动物是否会患有NSCLC的产品中的应用。
5. 检测miR-21、miR-210和miR-31表达量的液相芯片miRNA检测试剂和/或仪器在 制备预测或辅助预测待测患者是否会发生NSCLC复发的产品中的应用。
6. 根据权利要求1-5中任一所述的应用，其特征在于： 所述检测miR-21、miR-210和miR-31表达量的液相芯片miRNA检测试剂和/或仪器为 检测miR-21、miR-210和miR-31表达量的液相芯片miRNA检测试剂盒； 所述试剂盒包括miR-21嵌合探针、miR-210嵌合探针、miR-31嵌合探针、固定有探针A 的聚苯乙烯微球、固定有探针B的聚苯乙烯微球、固定有探针C的聚苯乙烯微球； 所述探针A能结合所述miR-21嵌合探针； 所述探针B能结合所述miR-210嵌合探针； 所述探针C能结合所述miR-31嵌合探针； 所述miR-21嵌合探针的核苷酸序列为序列表中序列1 ; 所述miR-210嵌合探针的核苷酸序列为序列表中序列2 ; 所述miR-31嵌合探针的核苷酸序列为序列表中序列3 ; 所述探针A的核苷酸序列为序列4 ; 所述探针B的核苷酸序列为序列5 ; 所述探针C的核苷酸序列为序列6。
7. 根据权利要求6所述的应用，其特征在于： 所述各嵌合探针5'端均标记荧光基团生物素； 所述试剂盒还包括荧光标记物SAPE、miR-21、miR-210和miR-31 ; 所述miR-21的核苷酸序列为序列7 ; 所述miR-210的核苷酸序列为序列8 ; 所述miR-31的核苷酸序列为序列9。
8. 检测miR-21、miR-210和miR-31表达量的液相芯片miRNA检测试剂盒，为如下1)或 2)： 1) 鉴定或辅助鉴定待测样本是否为NSCLC癌组织的产品； 2) 鉴定或辅助鉴定待测患者是否为NSCLC患者的产品。
9. 根据权利要求8所述的试剂盒，其特性在于： 所述试剂盒包括miR-21嵌合探针、miR-210嵌合探针、miR-31嵌合探针、固定有探针A 的聚苯乙烯微球、固定有探针B的聚苯乙烯微球、固定有探针C的聚苯乙烯微球； 所述探针A能结合所述miR-21嵌合探针； 所述探针B能结合所述miR-210嵌合探针； 所述探针C能结合所述miR-31嵌合探针； 所述miR-21嵌合探针的核苷酸序列为序列表中序列1 ; 所述miR-210嵌合探针的核苷酸序列为序列表中序列2 ; 所述miR-31嵌合探针的核苷酸序列为序列表中序列3 ; 所述探针A的核苷酸序列为序列4 ; 所述探针B的核苷酸序列为序列5 ; 所述探针C的核苷酸序列为序列6 ; 所述各嵌合探针5'端均标记荧光基团生物素。
10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特性在于： 所述试剂盒还包括荧光标记物SAPE、miR-21、miR-210和miR-31 ; 所述miR-21的核苷酸序列为序列7 ; 所述miR-210的核苷酸序列为序列8 ; 所述miR-31的核苷酸序列为序列9 ; 所述试剂盒还包括记载如下标准的可读载体：若所述待测样本的RNA中miR-21的表达 量大于1478. 3amol/y 1，且miR-210的表达量大于2. 49amol/y 1，且miR-31的表达量大于 2. 57amol/ y 1，则所述待测样本为或候选为NSCLC癌组织；若所述待测样本RNA中miR-21、 miR-210和miR-31的表达量不满足上述标准，则所述待测样本不为或候选不为NSCLC癌组 织。
【专利摘要】本发明公开了液相芯片miRNA检测试剂盒。本发明提供了检测miR-21、miR-210和miR-31表达量的液相芯片miRNA检测试剂盒在制备鉴定或辅助鉴定待测样本是否为NSCLC癌组织的产品中的应用。本发明还提供了检测miR-21、miR-210和miR-31表达量的液相芯片miRNA检测试剂盒在制备鉴定或辅助鉴定待测患者是否为NSCLC患者的产品中的应用。本发明的实验证明，对26例不同期NSCLC肺癌患者肿瘤组织miRNAs进行表达量检测，发现miR-21、miR-210和miR-31可以作为标志组合物，用于判断是否为NSCLC肺癌患者，其预测准确率为94.2％。具有临床操作简便、高通量、可自由组合，绝对定量等特点，尤其能够对NSCLC肺癌进行早期诊断，增加治愈的成功率。
【IPC分类】C12N15-11, C12Q1-68
【公开号】CN104877999
【申请号】CN201510256039
【发明人】李富荣, 余小舫, 王正, 陈月, 费筠
【申请人】深圳市人民医院
【公开日】2015年9月2日
【申请日】2015年5月19日