诱导体细胞转分化为神经干细胞的方法及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术和神经发育领域，具体地，本发明涉及一种诱导体细胞转转 分化为神经干细胞的方法及其应用。
【背景技术】
[0002] 终末分化细胞被认为是一类具有特定功能和表型，并丧失进一步发育潜能的细 胞。但是，早期研究发现终末分化细胞的细胞核可被用于克隆动物，此外，体外细胞融合也 可以导致细胞谱系的重编程，以上结果表明发育过程中的表观遗传学修饰是可逆的。近期 大量研究发现，通过特异转录因子组合不但可以诱导体细胞通过重编程去分化为多潜能干 细胞，也可以直接转分化为其他谱系的特定体细胞，从而为病人的个性化治疗提供新的细 胞来源。
[0003] 神经干细胞是一类能够自我增殖、更新和分化为不同神经类细胞的细胞，具有巨 大的研究和临床应用价值。目前，从脑组织提取神经干细胞和从胚胎干细胞和诱导性多能 干细胞分化为神经干细胞的方法已经成熟，此外，不同因子组合诱导体细胞转分化为神经 干细胞的方法也日渐完善；但是现有的转分化方法涉及到外源基因的介入，具有很大的临 床安全隐患。
[0004] 因此，本领域迫切需要开发不需要外源基因介入的诱导体细胞转分化为神经干细 胞将为神经干细胞的方法。
【发明内容】
[0005] 本发明提供了一种在低氧（尤其是正常生理低氧）环境下诱导体细胞转分化为神 经干细胞将为神经干细胞。
[0006] 本发明第一方面，提供了一种小分子化合物组合，所述的小分子化合物包括以下 组分：
[0007] (a)组蛋白去乙酰化酶（HDACs)抑制剂；
[0008] (b)糖原合成酶激酶（GSK-3)抑制剂；
[0009] (c)转化生长因子β (TGF-β )信号通路抑制剂；和 [0010] (d)任选的药学上可接受的载体。
[0011] 本发明第二方面，提供了一种小分子化合物组合，所述的小分子化合物由以下组 分构成：
[0012] (a)组蛋白去乙酰化酶（HDACs)抑制剂；
[0013] (b)糖原合成酶激酶（GSK-3)抑制剂；
[0014] (c)转化生长因子β (TGF-β )信号通路抑制剂。
[0015] 本发明第三方面，提供了第一或第二方面所述的组合物的用途，用于在低氧环境 下诱导体细胞转分化为神经干细胞。
[0016] 在另一优选例中，所述的低氧环境包括正常生理低氧环境。
[0017] 在另一优选例中，所述的低氧环境为氧浓度3-8%的环境，较佳地，为4-6%。
[0018] 在另一优选例中，所述的体细胞包括成纤维细胞、上皮细胞。
[0019] 在另一优选例中，所述的体细胞来源于哺乳动物，较佳地为人、啮齿动物（小鼠、 大鼠）。
[0020] 在另一优选例中，所述的成纤维细胞包括小鼠胚胎成纤维细胞、小鼠尾尖成纤维 细胞、人皮肤成纤维细胞。
[0021] 在另一优选例中，所述的上皮细胞分离自人尿液。
[0022] 本发明第四方面，提供了一种体外诱导体细胞转分化为神经干细胞的方法，在低 氧环境以及本发明第一或第二方面所述的小分子化合物组合存在的培养条件下，培养体细 胞。
[0023] 在另一优选例中，所述的培养条件还包括神经干细胞培养基。
[0024] 在另一优选例中，所述的神经干细胞培养基含有表皮生长因子EGF、碱性成纤维细 胞生长因子bFGF、肝素、或其组合。
[0025] 在另一优选例中，所述的培养为至少培养4代，较佳地，至少5-8代，更佳地，至少 10-15 代。
[0026] 在另一优选例中，所述的小分子化合物组合中HDACs抑制剂包括丙戊酸钠（VPA)、 丁酸钠（NaB)、或曲古抑菌素 A(TSA);和/或
[0027] 所述的GSK-3抑制剂包括CHIR99021、氯化锂（LiCl)、或碳酸锂（Li2CO 3);和/或
[0028] 所述的TGF-β信号通路抑制剂包括R印sox、SB431542、或曲尼司特（Tranilast)。
[0029] 在另一优选例中，所述小分子化合物组合中各组分的最低有效浓度如下所示：
[0030] HDACs 抑制剂：VPA :0· 2-lmM，较佳地 0· 3-0. 8mM，更佳地，0· 4-0. 6mM ;NaB0. 2-lmM， 较佳地(λ 3-0. 8mM，更佳地，(λ 4-0. 6mM ;TSA5-20nM，8-15nM，更佳地，10-12nM ;
[0031] GSK-3 抑制剂：CHIR990211-5yM，较佳地 2-4μΜ ;LiC10. 5-3μΜ，较佳地 1-2μΜ ; Li2CO30.0 5-lmM，较佳地，0· 1-0. 8mM，更佳地，0· 2-0. 5mM ;
[0032] TGF-β 抑制剂信号通路：ItepsoxO· 2-3μΜ，较佳地，0· 5-2μΜ ; SB4315420. 2-3 μ Μ，较佳地 0· 5-2 μ M ;Tranilastl0-50 μ Μ，较佳地，20-40 μ Μ。
[0033] 本发明第五方面，提供了一种神经干细胞，所述的神经干细胞是由本发明第四方 面所述的方法制备的。
[0034] 在另一优选例中，所述的神经干细胞具有以下一个或多个特征：
[0035] (i)神经干细胞特异性基因高表达；
[0036] (ii)神经干细胞多能性基因高表达；
[0037] (iii)神经干细胞具有分化多潜能性。
[0038] 在另一优选例中，所述的神经干细胞特异性基因包括Nestin、Sox2、Blbp、Pax6和 Ascll0
[0039] 在另一优选例中，所述的神经干细胞多能性基因包括Nestin、Sox2、Blbp和Pax6。
[0040] 在另一优选例中，用于制备预防或治疗神经系统疾病的药物组合物。
[0041] 在另一优选例中，所述的神经系统疾病包括神经退行性病变、由于基因突变引起 的神经系统疾病，以及因脑外伤或脑溢血等导致的神经系统病变。
[0042] 在另一优选例中，所述的神经系统疾病包括阿尔兹海默病、帕金森症、或亨廷顿舞 蹈症。
[0043] 本发明第六方面，提供了一种组合物，所述的组合物包括：本发明第五方面所述的 神经干细胞。
[0044] 在另一优选例中,所述的组合物包括药物组合物、食品组合物、保健品组合物。
[0045] 应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文（如实施例）中具 体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在 此不再一一累述。
【附图说明】
[0046] 图UVCRP在正常生理低氧条件下诱导小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs)形成致密细胞 克隆。图IA显示了 VCRP处理15天后，不同氧浓度（21%、3%和5%)条件下MEFs的形态学 变化。20, 0000细胞种植于6孔板并在21%氧浓度下培养24小时后更换为包含有小分子化 合物组合 VCRP (0.5mM VPA、3yM CHIR99021、lyM R印sox 和 2μΜ Parnate)的 KSR 培养 液，每5天更换一次培养液直至20天；处理至第10天，仅正常生理低氧条件下的药物处理 组开始出现致密细胞克隆。右图为细胞克隆数目统计。图IB显示了正常生理低氧条件下 VCR处理组的致密细胞克隆的碱性磷酸酶（AP)表达量显著增高。每20, 0000细胞中约有40 个克隆，其中3/4的克隆表达碱性磷酸酶。标尺为200 μ m ;所有数据采用mean土SEM ;代表 性图片来自于至少三次的独立实验。
[0047] 图2、筛选VCRP组合中的必要化合物。图2A显示了正常生理低氧条件下，不同 化合物组合诱导MEFs产生的克隆数目。图2B显示了正常生理低氧条件下，VCR (0.5mM VPA、3yM CHIR99021 和 ΙμΜ R印sox)基础之上添加其他化合物（ΙμΜ OACl (0)，7·5μΜ Luteolin (L)，300ng/mL poly I:C(I))诱导细胞产生的克隆数目（第15天)。图2C显示 了 MEFs在不同氧浓度（21%和5%)下经VCR处理10天后的Sox2表达量检测。图2D显示 了正常生理低氧条件下，不同化合物及其组合处理细胞10天后的Sox2表达量检测。所有 数据采用mean土SEM ;代表性图片来自于至少三次的独立实验。
[0048] 图3、化合物组合VCR在生理正常生理低氧条件下诱导小鼠胚胎成纤维细胞到神 经干细胞。图3A显示了化合物组合VCR在生理正常生理低氧条件下诱导碱性磷酸酶AP阳 性的致密克隆。小鼠胚胎成纤维细胞在21%(正常氧压）或5%(正常生理低氧）02培养条 件下，用化合物组合VCR(0. 5mM VPA、3 μ MCHIR99021和1 μ M R印sox)处理。克隆是在VCR 处理15天后计数的。柱形图代表起始的20万细胞诱导产生的克隆数目。图3B显示了定 量链式聚合酶反应检测多能性相关基因的相对表达水平。所有的样品都归一化到第〇天， 第〇天的值为1。图3C显示了 VCR诱导产生神经干细胞状的细胞群。VCR处理的小鼠胚胎 成纤维细胞经消化后在神经胚胎干细胞培养基中培养（小鼠胚胎成纤维细胞和第1、5和13 代）。图3D显示了定量链式聚合酶反应检测神经干细胞特异基因的相对表达水平。所有的 样品都归一化到小鼠胚胎成纤维细胞的表达水平，小鼠胚胎成纤维细胞的表达水平值为1。 图3E显示了免疫荧光染色Nestin、Pax6和Sox2。细胞核用DAPI染色。Nestin/Pax6和 Nestin/Sox2双阳性的细胞在右边的通道展示。图片标尺为50μηι。图3F显示了从小鼠胚 胎成纤维细胞诱导神经干细胞的实验策略流程图。数据是平均值土标准误，且至少进行三 次重复实验，***Ρ〈〇· 001，**Ρ〈〇· 01。
[0049] 图4、诱导MEFs转分化为神经干细胞（ciNPCs)。图4A显示了第1代ciNPCs的形 态，Nestin、Sox2和Pax6的表达量检测。VCR处理的MEFs在包含有生长因子的神经培养液 中继续培养7-10天，可观察到类似神经干细胞形态出现。通过免疫荧光染色检测了神经干 细胞标记蛋白Nestin、Sox2和Pax6等的表达，并对阳性细胞进行统计。这类细胞经过进一 步悬浮培养可形成Sox2和Nestin阳性的神经球。图4B显示了原代神经球经过更长代数 的悬浮培养可以富集Nestin、Sox2和Pax6等阳性细胞的比例。标尺为200 μ m ;所有数据 采用mean土SEM ;代表性图片来自于至少三次的独立实验。
[0050] 图5、纯化合物诱导的神经干细胞比例统计。图5A显示了第13代ciNPCs的免疫 荧光染色（Nestin和Sox2)。图5B显示了图5A中Nestin和Sox2阳性细胞数目统计。图 5C显示了第13代ciNPCs的免疫荧光染色（Nestin和Pax6)。图显示了图5C中Nestin 和Pax6阳性细胞数目统计。代表性图片来自于至少三次的独立实验。
[0051] 图6、化合物诱导的神经干细胞的增殖和自我更新。图6A显示了第13代的