lipore，TMS-001-C)。小鼠神经干细胞取自E12. 5天的小鼠胚胎，在神经 细胞扩大培养液（NEM)中培养，添加30ng/ml h印rin，20ng/ml EGF和20ng/ml bFGF。人尿 细胞（分离自人尿液的上皮细胞）收集和培养在REGM (Lonza，CC-4127)培液中。
[0115] ciNPCs 的诱导
[0116] 对于MEFs和TTFs的神经干细胞诱导，起始细胞在DMEM中培养24小时后换成KSR 培液，其中包含 knockout DMEM (Life Technologies, 10829-018) 15% 去除血清替代物， 1%NEAA (Life Technologies, 35050)，l%Glutamax (Life Technologies, 35050-061)，1% 丙 丽酸纳（Life Technologies, 11360),0. ΙπιΜβ 疏基乙醇（Life Technologies, 21985-023) 和lOOOU/ml的白血病抑制因子（LIF) (Chemicon，ESG1107)。细胞培养在37°C，5%02 (hypoxia)和5%C02条件下。含有化合物的培液每五天换一次。对于人细胞的ciNPCs诱 导，尿细胞铺在Matrigel包被的6孔板培养在RGEM培养液。2天后，培液换成mTeSR( Stem Cell Technologies, 05850/05896)并包含化合物组合并且在 37°C，5%02 (hypoxia)，5%C02 条件下培养。培液每5天换一次。当小鼠成纤维细胞或人尿细胞培养过程中形成紧密的细 胞克隆，包含克隆的细胞混液在添加了生长因子的NEM中进一步培养。ciNPCs在多轮神经 球悬浮培养过程中进一步富集。
[0117] ciNPCs的体外分化
[0118] 小鼠成纤维细胞来源的c iNPCs培养在神经细胞扩大培养液中，其中添加 EGF (20ng/ml)和 bFGF( 20ng/ml)。对于通用的神经分化方法，20000ciNPCs 铺到 PDL/Laminin 包 被的24孔板上，在不含EGF和bFGF的N2B27(DMEM:F12, 1%N2, 2%B27)培液中培养。稳定的 星形胶质细胞生成诱导是在无生长因子的N2B27中添加 BMP4 (50ng/ml;R&D Biosystems) 和1%FBS。神经元分化则是将ciNPCs铺在roL/Laminin包被的盖玻片上，在神经分化培养 基（Neural basal medium, 2%B27，l%N2，10ng/ml BDNF，10ng/ml GDNF，10ng/ml IGF-Ι,ΙμΜ cAMP, 200 μ M Ascorbic acid)中培养。神经元分子标记基因表达和电生理分析分别在特定 的时间点进行检测。而少突胶质细胞的分化，则是将20000细胞铺在roL/Laminin包被的 盖玻片上，在包含 bFGF (10ng/mL; Invitrogen)和 F1DGF-AA (10ng/mL; Peprotech)的 N2B27 培养中培养7天，然后加入T3 (100ng/mL;20Sigma-Aldrich)后分化5天。
[0119] 对于hUC来源的ciNPC的神经元分化，神经球用accutase (Life Technologies) 消化以后，10000细胞铺至Poly-L-ornithine/laminin包被的玻片上。第二天，培养液中 撤去EGF和bFGF，加入神经营养因子，其中包括BDNF，⑶NF，IGF (均为10ng/mL)和IOOmM cAMP，200ng/mL的ascorbic acid。神经元分化培液两天换一次，2周以后，检测神经元分子 标记的表达，约50天以后，检测星形胶质细胞分子标记的表达。
[0120] 碱性磷酸酶分析
[0121] 染色之前，细胞用4%多聚甲醛固定2分钟。碱性磷酸酶（AP)染色参照生产商的 操作步骤用碱性磷酸酶试剂盒（Sigma-Aldrich, 85L3R)进行染色。图像获得采用Zeiss Observer Zl0
[0122] 免疫荧光染色
[0123] 培养于玻片上的细胞先用4%PFA溶液固定10分钟，然后在包含或不包含 0.5%TritonX_100 的封闭缓冲液（l%bovine serum albumin in PBS)中室温（RT)封 闭30分钟。随后，样品孵育一抗4°C过夜，而后和适合的突光二抗室温孵育1小时。细 胞核用DAPI进行染色。图片分别用荧光显微镜（Olympus 1X71)和Leica Sp-8共 聚焦显微镜拍照。采用的特异性一抗包括Nestin (l:1000，Millip〇re，MAB5326)， Sox2 ( 1:200, R&D,AF2018), Pax6 ( I : 500, Covance, RPB-278P)，K i 6 7 (1:500,Abeam, ab15580), GFAP (1:1000,Dako, Z0334), Tuj (1:500,Covance, MMS435P), MAP2 (1:250, Millipore,AB5622), MBP (1:250,Covance, SMI94), 01igo2 (1:400,Santa Cruz, sc-19969), NeuN (1:200, Millipore, MAB377), GAD67 (1:200, Millipore, MAB5406), Synapsin (1:200, Millipore, AB1543), Glutamate (1:200, Millipore, MAB5304)〇
[0124] 神经球的染色，神经球悬液先转移至15ml管，使神经球自然沉降。然后将神经球 于4%PFA中室温固定15分钟，于4°C 5ml30%蔗糖中孵育过夜直到稳定。神经球沉淀转移至 cryostat chuck上的组织冻存液中（Leica, 020108926)。10 μ m厚度的神经球切片准备并 包埋在箔中，保存于_80°C待分析。
[0125] 小鼠大脑切片制备如前所述。简单来说，用4%PFA PBS心脏灌流小鼠大脑。冷冻 于30%蔗糖后，小鼠大脑以20 μ m厚冰切并做免疫荧光染色分析。
[0126] 基因芯片分析
[0127] 全基因组表达分析由Shanghai OE Biotech. Co.，Ltd公司根据安捷伦科技 基于单色芯片分析的操作方法进行。简单来说，RNA样品根据生产商说明书用TRIzoI (Sigma-Aldrich, T9424)进行抽提，并且 RNA 完整性用 Agilent2100bioanalyzer 进行分 析。每个样品的200ng总RNA通过单色快速标记扩增试剂盒（Agilent, 5190-2305)进行 标记反应。标记扩增好的RNA用RNeasy mini试剂盒（Qiagen, 74104)进行纯化。用于 8X60array的cDNA芯片来自安捷伦科技，并且采用安捷伦基因表达杂交试剂盒（catalog number:G4852A)。于65°C杂交17小时并清洗后，芯片用安捷伦芯片扫描仪（Agilent Technologies, USA)进行扫描。图像提取软件（versionlO. 7. I. 1，Agilent Technologies) 用于分析芯片图像来获得原始数据。GeneSpring软件用于完成对原始数据的基础分析。首 先，采用分位数算法对原始数据进行归一化。差异表达的基因通过倍数变化并设置10的阈 值来进行鉴别。随后Gene Ontology(GO)分析和KEGG分析应用于确定这些差异表达mRNAs 的作用。来自entrenz-gene数据库的39430个基因的55821个探针被检测。
[0128] 定量实时PCR
[0129] 细胞总RNA根据生产商说明书（Sigma-Aldrich, T9424)用Trizol试剂进行抽提。 抽提的RNA采用随机六聚体引物和M-MLV反转录酶（Promega)反转为cDNA。cDNA样品与 2XPCR mix (Qiagen)和 Eva Green (Biotium)混合后置于 MX3000P Stratagene PCR 仪进 行实时定量PCR分析。相对表达量通过与内参（HPRT)比较进行归一化处理。PCR所用引物 的序列如下：
[0131] 电生理分析
[0132] 对ciNPC分化获得的neurons进行全细胞膜片钳记录。采用Multiclamp700B amplifier (Molecular Devices)进行记录。包含神经元的玻片始终保持在常温且有新 鲜的人工脑脊液（ACSF)中。ACSF 包含 126mM NaCl，3mM KC1，L 25mM KH2PO4L 3mM MgSO4, 3. 2mM CaCl2,26mM NaHCOjPlOmM 的葡萄糖，用 95%02和5%(：02吹出气泡。信号在 IOkHz with a2kHz low-pass过滤器中进行采样.全细胞电容被全补偿。Ra>50M或信号波动>20%的信 号被排除。细胞内液包含93mM K-gluconate，16mM KCl，2mM MgC12，10mM HEPES4mM ATP-Mg， 0. 3mM GTP-Na2, IOmM creatine phosphate, 0. 5%Alexa Fluor568hydrazide (Invitrogen) (pH7.25,290/300m0sm)，0.4%neurobiotin (Invitrogen)。膜电位稳定在约-70mV,米用 2pA增量的反复电流的输入来激发动作电位。采用-70至+70mV的电位差来激活钠离子内 向电流和钾离子外向电流。数据均用pClamp (Clampfit)进行分析。
[0133] 体内移植
[0134] 体内移植按照文献进行操作。简单来说，E13. 5天孕期的孕鼠 C57BL/6的子宫角 培养在无菌的环境中。包含约20个GFP-ciNPC神经球的PBS通过斜角校准的玻璃微管注 入到胚胎脑室，其中神经球的直径不得超过80 μ m。此后，子宫角被替代，腹膜腔用IOmL温 热PBS进行灌洗,PBS含有抗生素,然后缝合伤口。1周或1月之后，小鼠在冰上麻醉或者戊 巴比妥钠麻醉，脑片制备如前所述并可用于后续分析。
[0135] 动物饲养
[0136] 所有小鼠可以随时获得给予的食物和水。所有实验都遵守动物关爱与利用国家研 究机构健康指南进行操作并由中科院上海生命科学研究院生物研究伦理委员会批准。
[0137] 数据分析
[0138] 所有定量数据按照期望标准误来进行统计分析。除非有其他说明，统计显著性差 异均由单向方差分析完成，并以P值的形式具体在文章和图片叙述中阐述。
[0139] 实施例1正常生理低氧条件下筛选诱导体细胞产生神经干细胞的化合物组合
[0140] I. 1筛选VPCR组合在正常生理低氧情况下培养体细胞形成的克隆情况
[0141] 通过大量组合物筛选，基本确定采用化合物组合VPCR (VPA、CHIR99021、Itepsox和 Parnate)在3%或者5%02条件下处理小鼠成纤维细胞10天