用于制备闭合线状dna的体外无细胞方法的试剂盒的制作方法
【专利说明】
[0001] 本申请是申请日为2010年2月1日的题为"闭合线状DNA的制备"的中国专利申 请号201080006024. 8的分案申请。
技术领域
[0002] 本发明涉及一种用于制备闭合线状脱氧核糖核酸（DNA)的体外、无细胞方法。
【背景技术】
[0003] 用于大量扩增DNA的传统的基于细胞的方法成本较高。例如，细菌的使用需要它 们在昂贵的发酵罐内大体积生长，发酵罐需要保持在无菌状态以防止培养物的污染。还需 要裂解细菌以释放扩增的DNA并且需要将所述DNA从其他细菌组分中清洗并且纯化出来。 特别是在制备DNA疫苗或其他治疗性DNA药物时，需要高纯度以除去对哺乳动物具有毒性 的内毒素。
[0004] 除了成本问题之外，细菌的使用在许多情况下为扩增方法的保真度造成困难。在 细菌细胞复杂的生物化学环境中，难以控制所需DNA产物的质量和收率。细菌有时会改变 克隆在扩增DNA中的所需基因并且使其对于所需目的无用。重组事件还可能会导致感兴趣 的DNA的忠实制备中存在问题。用于扩增DNA的无细胞酶法避免了使用宿主细胞，所以是 有利的。
[0005] 例如，制备药用DNA表达盒几乎不例外地依赖于将它们插入细菌质粒并且在细菌 发酵过程中进行扩增。
[0006] 该现有技术方法在许多方面限制了改进此类DNA药物制备的机会。此外，质粒产 物主要是粗DNA分子，因为其包含药用功能不需要的核苷酸序列。因此，在制备DNA产物例 如DNA药物的领域中，需要提供用于大量扩增DNA的改进方法。特别是需要提供用于扩增 特定形式的DNA例如闭合线状DNA的改进方法。由于闭合线状DNA分子与其他形式的DNA 相比具有更高的稳定性和安全性，所以在治疗应用中具有特别的用途。
【发明内容】
[0007] 本发明涉及体外、无细胞制备线状共价闭合DNA(闭合线状DNA)的方法。该方法 与涉及细胞处理和在质粒内扩增的传统方法相比能够增强线状共价闭合DNA的制备。这显 著增加了该方法的生产力并同时降低产品纯化的成本。
[0008] 根据本发明，在无宿主细胞的条件下用酶从DNA模板制备线状共价闭合DNA。该模 板DNA包含至少一个原核端粒酶（protelomerase，一种菌体编码的酶）祀序列。使该模 板DNA与至少一种DNA聚合酶在促进该模板扩增的条件下在一种或多种引物存在下接触。 使从该模板扩增的DNA与至少一种原核端粒酶在促进闭合线状DNA制备的条件下接触。
[0009] 因此，本发明提供用于制备闭合线状脱氧核糖核酸（DNA)的体外无细胞方法，其 包括：
[0010] (a)使包含至少一个原核端粒酶靶序列的DNA模板与至少一种DNA聚合酶在一种 或多种引物存在下在促进所述模板扩增的条件下接触；和
[0011] (b)使（a)中制备的扩增DNA与至少一种原核端粒酶在促进闭合线状DNA制备的 条件下接触。
[0012] 本发明还涉及提供对于本发明方法必要的组分的试剂盒。因此，本发明提供包含 至少一种DNA聚合酶和至少一种原核端粒酶以及本发明方法的使用说明的试剂盒。
【附图说明】
[0013] 图1 :噬菌体中线状共价闭合DNA的复制以及原核端粒酶的作用。A.染色体外噬 菌体线状共价闭合DNA的示意图。*=端粒回文序列的中心。R序列是L序列的反转回文重 复。B.宿主内噬菌体DNA的复制：泡表示DNA链复制。对于R和L的互补链的合成得到了 相同的双链RL序列。C.在原核端粒酶作用下形成的产物。原核端粒酶结合至RL序列并且 在回文序列的中心点切割并连接相反链从而重新形成端粒并且完成原始线状共价闭合DNA 的复制。
[0014] 图2 :大肠杆菌噬菌体N15原核端粒酶（TelN)对包含其靶位点telRL的环状双链 DNA的作用。TelRL是具有由箭头指出的28bp右臂（telR)和左臂（telL)的反转回文序列。 下划线示出的序列表示telRL回文序列中的缺陷。中间22bp的完整反转回文序列TelO对 于酶TelN的结合是必需的。TelN在其中点裂解该22bp序列并且将互补序列的末端连接形 成共价闭合末端。
[0015] 图3 :比较存在于各种生物体中的原核端粒酶靶序列。加框序列表示完整的或不 完整的回文序列的范围。下划线表示该回文序列中的缺陷。突出显示的碱基对序列是所有 原核端粒酶靶序列共有的，表明它们对于原核端粒酶结合和发挥作用的重要性。A.大肠杆 菌菌体N15。B.克雷伯氏菌属（Klebsiella) 菌体Phi K02。C.耶尔森菌属（Yersinia) 菌体Py54。D.盐单胞菌属（Halomonas) 菌体Phi HAP。E.弧菌属（Vibrio) 菌体 VP882。F.伯氏疏螺旋体（Borrelia burgdorferi)质粒1ρΒ31. 16。加框序列表示每一种 噬菌体的完整或不完整的回文序列的范围。G.示出了用于噬菌体原核端粒酶结合并发挥作 用的共有反转回文序列。其为具有22个碱基对的完整反转重复序列（切割位点每一边各 11个碱基对）。该共有序列衍生自A-E的突出显示的保守残基。显示出保守碱基对以及它 们在回文序列中的位置。短横线表示序列组成中的可变性，即碱基可能为N(A、T、C或G)的 情况。
[0016] 图4 :使用RCA链置换DNA聚合酶以及TelN原核端粒酶体外扩增线状双链共价闭 合DNA的具体方法。A.闭合线状DNA模板。R和L表示TelN原核端粒酶结合序列的右臂 和左臂的DNA序列。B.起始模板变性形成环状单链DNA。C.引物结合。D-E.通过RCA链 置换DNA聚合酶从单链DNA模板进行滚环扩增。F.形成长多联体双链DNA，其包含被原核 端粒酶结合序列（RU分离的单个单元的已扩增模板。G.与对RL序列具有特异性的TelN 原核端粒酶接触。原核端粒酶在RL位点裂解多联体DNA并且连接互补链以产生原始线状 共价闭合DNA模板的扩增拷贝。
[0017] 图5 :从长双链DNA分子切割表达感兴趣的基因的DNA表达盒以产生闭合线状DNA 表达盒。A.线状双链DNA分子，其包含的DNA表达盒包含感兴趣的基因，其两侧侧接原核端 粒酶靶序列。B.以线状共价闭合DNA分子切割所述DNA表达盒。
[0018] 图6 :扩增闭合线状DNA和用于"狗骨状（doggybone)"表达盒的报告基因表达。
[0019] A.通过琼脂糖凝胶电泳验证RCA扩增的多联体的TelN裂解以形成闭合线状DNA。 泳道1-3表示RCA扩增的pUC18。泳道1 :3微升未消化的RCA扩增的pUC18。泳道2 :2微 升用Pvul消化的RCA扩增的pUC18。泳道3 :2微升用TelN处理的RCA扩增的pUC18 (阴 性对照）。泳道4-6表示RCA扩增的pUC18telRL。泳道4 :3微升未消化的RCA扩增的 pUC18telRL。泳道5 :1微升用Pvul消化的RCA扩增的pUC18telRL。泳道6 :4微升用TelN 处理的RCA扩增的pUC18telRL。示出了用TelN处理生成的2. 7kb闭合线状DNA。两侧的 泳道为DNA大小标准物。
[0020] B.显示闭合线状DNA对热变性的耐性的Lab-On-A-Chip(LOC)分析。泳道I :DNA 大小标准物。泳道2和3 :100ng PCR DOG。泳道4和5 :100ng变性的PCR DOG。泳道6和 7 :"狗骨状" DNA-用TelN处理的IOOng pGL D0G。泳道6和7 :"狗骨状DNA" -用TelN处 理并且变性的IOOng pGL D0G。
[0021] C.通过转染验证闭合线状DNA在细胞内的表达。y轴：平均萤火虫/海肾比 (Firefly/Renilla ratio) ;χ-轴：在转染中使用的线状DNA构建体。PCR pGL:来自Iuc基 因中的PGL4. 13的开放线状PCR片段。PCR DOG :用侧接telRL位点的引物从pGL DOG扩增 的开放线状PCR片段。"狗MP":分离自用PvuI消化（除去污染性载体DNA)并且用TelN裂 解的小量制备DNA的pGL DOG的闭合线状DNA。"狗RCA":用PvuI消化并且用TelN裂解的 通过RCA扩增的pGL DOG的闭合线状DNA。
【具体实施方式】
[0022] 序列描述
[0023] SEQ ID NO: 1是杆菌属噬菌体phi29DNA聚合酶的核酸序列。
[0024] SEQ ID NO:2是由SEQ ID NO: 1编码的杆菌属噬菌体phi29DNA聚合酶的氨基酸序 列。
[0025] SEQ ID NO:3是火球菌属（Pyrococcus sp)Deep Vent DNA聚合酶的氨基酸序列。
[0026] SEQ ID NO: 4 是嗜热脂肪芽胞杆菌（Bacillus stearothermophilus) DNA 聚合酶 I 的核酸序列。
[0027] SEQ ID N0:5是由SEQ ID N0:4编码的嗜热脂肪芽胞杆菌DNA聚合酶I的氨基酸 序列。
[0028] SEQ ID NO:6是盐单胞菌属（Halomonas)噬菌体phiHAP-Ι原核端粒酶核酸序列的 核酸序列。
[0029] SEQ ID N0:7是由SEQ ID N0:6编码的盐单胞菌属噬菌体phiHAP-Ι原核端粒酶的 氨基酸序列。
[0030] SEQ ID NO:8是耶尔森菌属（Yersinia)噬菌体PY54原核端粒酶的核酸序列。
[0031] SEQ ID N0:9是由SEQ ID N0:8编码的耶尔森菌属噬菌体PY54原核端粒酶的氨基 酸序列。
[0032] SEQ ID NO: 10是克雷伯氏菌属（Klebsiella)噬菌体phiK02原核端粒酶的核酸序 列。
[0033] SEQ ID NO: 11是由SEQ ID NO: 10编码的克雷伯氏菌属噬菌体phiK02原核端粒酶 的氨基酸序列。
[0034] SEQ ID NO: 12是弧菌属（Vibrio)噬菌体VP882原核端粒酶的核酸序列。
[0035] SEQ ID NO: 13是由SEQ ID NO: 12编码的弧菌属噬菌体VP882原核端粒酶的氨基 酸序列。
[0036] SEQ ID NO: 14是大肠杆菌噬菌体N15原核端粒酶（telN)和二次免疫阻抑物（cA) 核酸序列的核酸序列。
[0037] SEQ ID NO: 15是由SEQ ID NO: 14编码的大肠杆菌噬菌体N15原核端粒酶（telN) 的氨基酸序列。
[0038] SEQ ID NO: 16是存在于噬菌体原核端粒酶靶序列中的完整反转重复序列的共有 核酸序列。
[0039] SEQ ID NO: 17是来自大肠杆菌噬菌体N15和克雷伯氏菌属噬菌体phiK02的22碱 基完整反转重复核酸序列。
[0040] SEQ ID NO: 18是来自耶尔森菌属噬菌体PY54的22碱基完整反转重复核酸序列。
[0041] SEQ ID NO: 19是来自盐单胞菌属噬菌体phiHAP-Ι的22碱基完整反转重复核酸序 列。
[0042] SEQ ID NO: 20是来自弧菌属噬菌体VP882的22碱基完整反转重复核酸序列。
[0043] SEQ ID NO:21 是来自伯氏疏螺旋体（Borrelia burgdorferi)质粒 1ρΒ31· 16 的 14碱基完整反转重复核酸序列。
[0044] SEQ ID NO: 22是来自弧菌属噬菌体VP882的24碱基完整反转重复核酸序列。
[0045] SEQ ID NO: 23是来自耶尔森菌属噬菌体PY54的42碱基完整反转重复核酸序列。
[0046] SEQ ID NO: 24是来自盐单胞菌属噬菌体phiHAP-Ι的90碱基完整反转重复核酸序 列。
[0047] SEQ ID NO: 25是包含原核端粒酶靶序列的来自大肠杆菌噬菌体N15的核酸序列。
[0048] SEQ ID NO: 26是包含原核端粒酶靶序列的来自克雷伯氏菌属噬菌体phiK02的核 酸序列。
[0049] SEQ ID NO: 27是包含原核端粒酶靶序列的来自耶尔森菌属噬菌体PY54的核酸序 列。
[0050] SEQ ID NO: 28是包含原核端粒酶靶序列的来自弧菌属噬菌体VP882的核酸序列。
[0051] SEQ ID N0:29是包含原核端粒酶靶序列的来自伯氏疏螺旋体质粒1ρΒ31. 16的核 酸序列。
[0052] SEQ ID N0:30是用于TelN扩增的经修饰的寡核苷酸引物。
[0053] SEQ ID N0:31是用于TelN扩增的经修饰的寡核苷酸引物。
[0054] SEQ ID NO: 32是包含TelN识别位点telRL的合成寡核苷酸。
[0055] SEQ ID NO: 33是包含TelN识别位点telRL的合成寡核苷酸。
[0056] SEQ ID NO: 34是用于PCR DOG扩增的引物序列。
[0057] SEQ ID NO: 35是用于PCR DOG扩增的引物序列。
[0058] 本发明涉及用于制备线状双链共价闭合DNA即闭合线状DNA分子的方法。闭合线 状DNA分子通常包括还被描述为发