DNA) 〇
[0147] 将从DNA模板扩增的DNA与至少一种原核端粒酶在促进闭合线状DNA制备的条件 下温育。换言之，所述条件促进包含原核端粒酶靶序列的双链DNA的裂解和再连接以形成 具有发夹末端的共价闭合线状DNA。促进闭合线状DNA制备的条件包括使用允许制备闭合 线状DNA的任何温度，通常在20-90摄氏度的范围内。温度优选在25-40摄氏度的范围内， 例如约25-约35摄氏度，或约30摄氏度。可根据上文所列与DNA聚合酶的温度条件相关 的原理选择具体原核端粒酶的适当温度。与SEQ ID NO: 15的大肠杆菌噬菌体TelN原核端 粒酶一起使用的适合的温度是约25-约35摄氏度，例如约30摄氏度。
[0148] 促进闭合线状DNA制备的条件还包括存在原核端粒酶和适合的缓冲剂/pH以及对 酶的性能和稳定性必需的其他因素。适合的条件包括本领域已知的用于提供原核端粒酶 活性的任何条件。例如，当使用大肠杆菌噬菌体TelN原核端粒酶时，适合的缓冲剂为20mM TrisHCl，pH 7. 6 ;5mM CaCl2;50mM 谷氨酸钾；0.1 mM EDTA ;lmM 二硫苏糖醇（DTT)。还可选 择针对DNA聚合酶所列的那些选择用于维持最佳活性和稳定性的试剂和条件。
[0149] 在一些实施方式中，可能使用与用于DNA扩增的相同的条件提供原核端粒酶活 性。具体而言，已记载当同时或并行进行DNA扩增和原核端粒酶加工时使用相同的条件。在 其他实施方式中，当所使用的提供最佳DNA聚合酶活性的条件导致次最佳的原核端粒酶活 性时有必要改变反应条件。可通过过滤、透析和本领域已知的其他方法实现除去特定试剂 和改变反应条件。技术人员应能够容易地鉴定提供最佳DNA聚合酶活性和/或原核端粒酶 活性的条件。
[0150] 在特别优选的实施方式中，通过RCA DNA聚合酶优选phi29扩增DNA，进行DNA 扩增的缓冲条件与以下条件基本相同或基本由其组成：35mM Tris-HCl、50mM KCl、14mM MgCl2、10mM(NH4)2S0 4、4mM DTT、lmM dNTP，温度为25-35摄氏度例如约30摄氏度。接着优选 用TelN和/或优选在与以下条件基本相同或基本由其组成的缓冲条件下实现用原核端粒 酶进行的加工步骤：20mM TrisHCl，pH 7. 6 ;5mM CaCl2;50mM谷氨酸钾；0· ImM EDTA ;lmM二 硫苏糖醇（DTT)，温度为25-35摄氏度例如约30摄氏度。
[0151] 所有用于本发明方法的酶和蛋白质可为例如在细菌中重组制备。可使用技术人员 已知的能够重组表达的任何方法。可将包含编码感兴趣的蛋白质的核酸序列的质粒或其他 形式的表达载体引入细菌中，从而使得它们表达所编码的蛋白质。例如，对于SEQ ID NO: 2、5、7、9、11、13或15的表达，所述载体可分别包含SEQIDN0:1、4、6、8、10、12或14的序 列。然后通常通过例如使用亲和标记以纯化足够量的表达蛋白质并且以适合用于本发明方 法中的形式提供。技术人员根据它们的公知常识可常规性获得用于重组蛋白质制备的此类 方法。以上论述适用于提供本文所述任何蛋白质。
[0152] 可在与原核端粒酶接触前纯化通过使DNA模板与DNA聚合酶接触获得的扩增DNA。 因此，本发明方法还包括纯化从DNA模板扩增的DNA的步骤。但是，在优选的实施方式中， 实施该方法而未在与原核端粒酶接触前纯化已扩增的DNA。这意味着通常可在相同的容器 或溶液中连续进行扩增和加工步骤。在一些此类实施方式中，该方法涉及加入提供原核端 粒酶活性的缓冲剂，即提供促进形成闭合线状DNA的条件。
[0153] 通过原核端粒酶的作用产生闭合线状DNA之后，本发明方法还包括纯化线状共价 闭合DNA产物的步骤。通常进行上文所述的纯化用于除去任何不需要的产物。可通过本领 域已知的任何适合的方法进行纯化。例如，对扩增DNA或线状共价闭合DNA的加工可包括 酚/氯仿核酸纯化或使用选择性结合核酸的柱子例如可从Qiagen商购的那些。技术人员 可常规地确定用于分离扩增DNA的适合的纯化技术。
[0154] 一旦生成了线状共价闭合DNA并且纯化了足够的量，该方法还包括将其制成DNA 组合物，例如治疗性DNA组合物。治疗性DNA组合物包含上文所述类型的治疗性DNA分子。 此类组合物包含为适合通过所需途径给药的形式的治疗有效量的DNA，所述形式是例如气 雾剂、注射剂组合物或适合口腔、粘膜或局部给药的制剂。
[0155] 可使用本领域技术人员可获得的标准药物制剂化学和方法以常规药物制剂制备 DNA制剂。可使用任何药学可接受的载体或赋形剂。诸如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等 的辅助性物质可存在于赋形剂或溶媒中。这些赋形剂、溶媒和辅助性物质通常为制药级物 质，可将它们给药而不引起异常毒性并且在疫苗组合物的情况中不会在接受该组合物的个 体中诱导免疫应答。适合的载体可为脂质体。
[0156] 药学可接受的赋形剂包括但不限于液体例如水、盐水、聚乙烯二醇、透明质酸、甘 油和乙醇。还可在其中包含药学可接受的盐，例如矿物酸盐例如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐、 硫酸盐等；以及有机酸的盐，例如醋酸盐、丙酸盐、丙二酸盐、苯甲酸盐等。尽管不是必要 的，当所述组合物中包含肽、蛋白质或其他类似分子时还优选所述制剂包含充当特别是用 于这些分子的稳定剂的药学可接受的赋形剂。还可充当肽稳定剂的适合的载体的实例包 括但不限于制药级的右旋糖、蔗糖、乳糖、海藻糖、甘露醇、山梨醇、肌醇、葡聚糖等。其他适 合的载体包括但不限于淀粉、纤维素、磷酸钠或磷酸钙、柠檬酸、酒石酸、甘氨酸、高分子量 聚乙二醇（PEG)及其组合。对药学可接受的赋形剂、溶媒和辅助性物质的全面论述可参见 REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES (Mack Pub. Co. ,N.J. 1991)，其通过引用并入本文。
[0157] 本发明方法在体外无细胞环境中进行。因此，该方法在无宿主细胞存在下进行并 且通常包括使用纯化的酶组分。因此，模板DNA的扩增和通过原核端粒酶的加工通常通过 在适合的容器内使溶液中的反应组分接触进行。可选地地，可以固定形式例如结合至固体 载体提供特定组分。
[0158] 应理解可以任何规模实施本发明的方法。然而，优选以商业或工业规模实施该方 法用于扩增DNA，即以毫克或更大的量生成扩增DNA。优选所述方法生成至少一毫克、至少 10毫克、至少20毫克、至少50毫克或至少100毫克扩增DNA。还优选以毫克或更大的量生 成衍生自扩增DNA的最终闭合线状DNA产物。优选所述方法生成至少一毫克、至少2毫克、 至少5毫克、至少10毫克、至少20毫克、至少50毫克或至少100毫克闭合线状DNA。
[0159] 本发明还提供包含实施本发明方法所需要的组分的试剂盒。该试剂盒包含至少一 种DNA聚合酶和至少一种原核端粒酶以及可选地本文所述方法的使用说明。所述试剂盒可 包含两种、三种、四种、五种或更多种不同的DNA聚合酶。优选地，所述试剂盒包含至少一种 链置换型DNA聚合酶，还更优选RCA DNA聚合酶。特别优选所述试剂盒包含phi29DNA聚合 酶（SEQ ID NO: 2)、De印 Vent? DNA 聚合酶（SEQ ID NO: 3)或 Bst IDNA 聚合酶（SEQ ID N0:5)或任何一种变异体。在一些实施方式中，还可包含以其他方法复制DNA的DNA聚合 酶。所述试剂盒包含至少一种原核端粒酶。所述试剂盒可包含两种、三种、四种或更多种不 同的原核端粒酶。所述原核端粒酶可选自SEQ ID N0:5、7、9、ll、13或15中的任何一种或 任何一种的变异体。特别优选所述试剂盒包含大肠杆菌N15TelN(SEQ ID NO: 15)或其变异 体。
[0160] 所述试剂盒还包含至少一种单链结合蛋白（SSBP)。优选的SSBP为可商购自New England Biolabs, Inc的T4基因32蛋白。可在试剂盒中包含两种、三种、四种或更多种 不同的SSBP。该试剂盒可能还包含焦磷酸酶。优选的焦磷酸酶为可商购自New England Biolabs, Inc的酿酒酵母焦磷酸酶。在一些实施方式中，可包含两种、三种、四种、五种或更 多种焦磷酸酶。所述试剂盒还可能包含本文所述的任何DNA聚合酶、原核端粒酶、SSBP或 焦磷酸酶。所述试剂盒还可能包含dNTP、适合的缓冲剂以及如上文所述DNA聚合酶和/或 原核端粒酶的酶性能或稳定性所需的其他因素。
[0161] 实施例
[0162] 实施例1-表汰TelN并目.牛成包含原核端粒酶靶序列的裁体构律体
[0163] 使用经修饰的寡核苷酸引物：
[0164] PTlF 5'ATGAGCAAGGTAAAAATCGGTG 3'（SEQ ID N0:30)
[0165] PTlR 5' TTAGCTGTAGTACGTTTCCCAT 3'（SEQ ID N0:31)
[0166] 从商购克隆载体PJAZZ(Lucigen)PCR扩增TelN用于定向框内克隆至商购pQE-30 载体（Qiagen)内。该系统使得能够从Iac启动子诱导表达6X N-端His标记蛋白质同时 提供来自IacI-表达质粒pREP4的反向强抑制。已在大肠杆菌M15中鉴定出许多推定的重 组克隆并且通过测序进行验证以证明TelN的框内插入。在小规模诱导实验中进一步表征 了六个克隆。所有克隆均表达了分子量对应于重组TelN原核端粒酶的74. 5kDa蛋白质。
[0167] 通过用IPTG诱导pQE-30的蛋白质表达从大肠杆菌M15pREP4表达TelN并且将 诱导的细胞进行超声处理（100%爆破6次，每次30秒）并离心（25000g，30min)，以从细 胞裂解物获得可溶性和不溶性组分。凝胶分析显示TelN存在于可溶性组分中。使用Akta Prime系统（GE Healthcare)并且以0-100% (0.5M)咪唑梯度洗脱，在HisTrap柱上纯化 TelN。将已纯化的TelN透析以除去咪唑并且保存在由IOmM Tris HCl pH 7. 4、75mM NaCl、 ImM DTT、0.1 mM EDTA和50%甘油组成的缓冲液中。
[0168] 通过将包含TelN识别位点telRL :
[0169] RLl
[0170] 5，AGCTTTATCAGCACACAATTGCCCATTATACGCGCGTATAATGGACTATTGTGTGCTGATAG 3' （SEQ ID N0:32)
[0171] RL2
[0172] 5，GATCCTATCAGCACACAATAGTCCATTATACGCGCGTATAATGGGCAATTGTGTGCTGATAA 3' （SEQ ID NO:33)
[0173] 的合成寡核苷酸定向克隆至质粒pUC18和pBR329的BamHI和HindIII位点内生 成能够验证TelN活性的载体构建体。pUC18的Genbank登录号为L09136并且可商购自 Fermentas Cat no. SD0051 ;pBR329 的 Genbank 登录号为 J01753 并且可商购自 DSMZ Cat no. 5590。
[0174] 此外，用于转染试验，将两个拷贝的telRL识别位点克隆至荧光素酶表达质粒 pGL4. 13 (Promega)中侧接萤火虫荧光酶基因表达盒的独特的SacI和BamHI限制性位点。 在telRL合成寡核苷酸与SacI突出端复性后将第一个telRL位点克隆至SV40启动子上游 的独特的SacI位点。使用具有BamHl突出端的telRL合成寡核苷酸将第二个telRL位点克 隆至SV40多腺苷酸化信号下游的独特的BamHl位点内。将所得构建体表示为pGL D0G，因 为它使得能够形成编码表达于哺乳动物细胞中的荧光素酶的共价闭合线状（狗骨状）DNA。
[0175] 实施例2-骀证TelN裂解
[0176] 验证TelN对超螺旋、环状pUC18telRL和pGL DOG载体构建体的裂解。将IOOng 各底物与4. 5pmol TelN在30摄氏度温育1小时40分钟。在TelN缓冲液[IOmM Tris HCl pH 7. 6、5mM CaCl2、50mM 谷氨酸钾、0.1 mM EDTA、lmM DTT]中进行该反应。
[0177] 通过非变性琼脂糖凝胶电泳使裂解产物可视化。超螺旋、环状PUClStelRL与TelN 温育释放了表明裂解的2. 7kb线状片段。超螺旋、环状pGL DOG与TelN温育释放了表明在 两个telRL位点裂解的两个2. 4kb片段。
[0178] 此外，通过限制性消化将pUC18telRL和pGL DOG线性化，然后与TelN温育以进一 步验证在telRL位点的特异裂解。用Xmnl将IOOng pUC18telRL线性化，然后与TelN温育。 这释放了预期的I. 9kb和0. 8kb片段。用Pvul将IOOng pGL DOG线性化，然后与TelN温 育。这释放了预期的2.4kb、1.6kb和0. 7kb片段。相似地，用Pstl线性化pGL DOG然后与 TelN温育释放了预期的2. 4kb、l. Ikb和另一 I. Ikb片段。这证明了 TelN对包含原核端粒 酶靶序列的环状和线状DNA底物的核酸内切酶活性。
[0179] 在对裂解活性的初期评价中，发现3. 4pmol的过量TelN可在1小时内切割至少 200ng pUC18telRL。在时段试验中，在约10分钟内切割