改进过表达碱性磷酸酶的酿酒酵母重组菌株中乙醇产率并减少生物质积累的制作方法
【专利说明】改进过表达碱性磷酸酶的酿酒酵母重组菌株中乙醇产率并 减少生物质积累 相关申请的交叉引用
[0001] 本申请要求2012年12月20日提交的美国临时专利申请号61/739, 904的优先权。
技术领域
[0002] 本发明涉及通过发酵生产乙醇的领域，并且更具体地说涉及在酿酒酵母中表达碱 性磷酸酶e基因以改进乙醇的生产同时减少生物质积累。 发明背景
[0003] 酒精发酵表示了在工业生物技术的领域中的酿酒酵母的最大应用，其中在2011 年超过800亿升的燃料、工业和饮料乙醇的生产。在过去的十年并且由于经济和环境原因， 世界范围内的燃料乙醇的生产已经经历了指数式增长（Schubert，2006)。虽然木质纤维素 被认为是用于生产燃料乙醇最有希望的原料之一，但是目前燃料乙醇的工业生产严重依赖 于传统原料（如，蔗糖（主要衍生自甘蔗或甜糖用甜菜）和从含淀粉材料获得的葡萄糖（玉 米、小麦、大麦、马铃薯等））的发酵。目前用于生物乙醇生产的最常见的生物是面包酵母、 酿酒酵母。这种酵母菌通过糖酵解恩布顿-迈耶霍夫途径（EMP)途径分解代谢葡萄糖产生 2摩尔ATP/摩尔消耗的葡萄糖。这种途径在酵母菌中的效率是低的，其中最大的生物质产 率约7%并且乙醇产率在理论值的90%与93%的范围内（Ingledew，1999)。然而，转化为 细胞物质的7%的糖的工业规模代表巨大量的副产品，虽然这些副产品作为动物饲料是有 价值的但是显著地降低目标产品乙醇的总产率。即使通过酿酒酵母在乙醇产率上的轻微的 改进，每年乙醇生产的全球产量可以增加几百万1升乙醇。
[0004] 与酿酒酵母相对比，细菌运动发酵单胞菌通过恩特纳-道德洛夫（ED)途径发酵 葡萄糖。这个途径给出了仅仅1摩尔ATP/摩尔葡萄糖，并且将仅仅3 %的葡萄糖引导至 细胞生物质中实现了高达97 %的可能的理论值的乙醇产率（Sprenger，1996)。这表明了 在酒精发酵过程中降低ATP产率水平增加了乙醇产率，其中底物向细胞物质的转化降低。 此外，运动发酵单胞菌（Z.mobilis)具有超过酿酒酵母的另一个重要的优点：将葡萄糖更 快的发酵成乙醇（Sprenger，1996, Panesar等人，2006)，运动发酵单胞菌的较高的繁殖力 (productivity)通常归因于较快的糖摄取速率以及随后的分解代谢而不是低ATP产率。以 用于生产工业乙醇的运动发酵单胞菌取代酿酒酵母的尝试被认为增加了 3% -4%的乙醇 产率，由此全世界每年增加了几亿升。然而，运动发酵单胞菌具有几个妨碍其工业用途的严 重的缺点，并且这些缺点由以下各项组成：（i)非常狭窄的底物范围（蔗糖几乎不发酵，具 有低的产率），（ii)赖氨酸、蛋氨酸和一些维生素的天然营养缺陷体，（iii)非GRAS的状态， 其阻止了作为饲料添加剂的生物质的使用，（iv)用于生长的较高的pH的需要（Jeffries， 2005 ;Bai等人，2008 ;阿巴斯，未公开出版的发现）。此外，用于酒精发酵的酵母菌细胞的技 术很好地发展，然而用于乙醇生产的细菌细胞的使用是很不常见的。因此，一种增加乙醇产 率并且减少细胞物质生产的更好的方法是构建在酒精发酵过程中产生更少的ATP(例如， 一摩尔ATP，如运动发酵单胞菌在ED途径中产生的）的酵母菌菌株。这些新的酵母菌菌株 将酵母菌的所有的可能的优点与运动发酵单胞菌的高的乙醇产率结合。存在几种可以用于 实现这个目标的方法，例如：由来自拥有该途径的基因的运动发酵单胞菌或其他细菌的ED 途径取代酵母菌中的EMP途径；增加在无效循环的产生中所涉及的酶的活性；构建具有提 高的ATP酶活性的重组菌株；并且引入编码质膜同向转运体的异源基因。
[0005] 尝试的第一种方法是在酿酒酵母的果糖磷酸激酶缺陷型突变体中表达ED脱水酶 和ED醛缩酶基因 edd和eda (Lancashire等人，1998)。所获得的酵母菌转化体成长并且将 葡萄糖发酵为乙醇，尽管没有测量ED脱水酶和ED醛缩酶的活性。在这项获得专利的工作 中描述的工作没有进一步发展，因为在科学文献中没有另外的报道。通常原核生物的酶在 酿酒酵母宿主中展示了低的活性或没有活性（Hahn-Hagerdal等人，2007)。这是可能的，在 某种程度上归因于在酵母菌中的所表达的细菌蛋白产物的不当地折叠或不稳定性。此外， 在酵母菌工程化的ED途径中的NADP再生上存在困难，因为在葡萄糖-6-磷酸脱氢酶反应 中产生的NADPH不能够通过醇脱氢酶反应再氧化。已经报道了在酿酒酵母中主要的醇脱氢 酶利用NADH但是不利用NADPH的并且酵母菌不具有NADH/NADPH转氢酶（Lescovac等人， 2002 Jeffries和Jin，2004)。为了在酵母菌酒精发酵过程中通过EMP途径维持低水平的 ATP，没有必要将它替代成一个具有较低效率的途径。实现以上目标的一种更好的方法是保 持EMP途径不变并且通过一种依赖于一些细胞溶质ATP酶的活化的更具体的方法或通过诱 导或构建某种无效循环以消散ATP的细胞池来降低ATP水平。
[0006] 在我们以前的工作中，我们通过过表达编码细胞溶质ATP酶结构域的酿酒酵母 SSBl基因的5'部分并且通过过表达编码来自大肠杆菌的腺苷三磷酸双磷酸酶的异源基因 apy进行了一个成功的尝试来减少细胞内ATP水平（Sibirny等人，2010)。一些所构建的菌 株示出了在厌氧、需氧或半厌氧培养过程中在细胞ATP水平上的减少并且其特征在于在在 厌氧、需氧或半厌氧条件下在葡萄糖利用过程中细胞生物质产率随着乙醇产率的相应增加 减少。我们提出这种方法可能对于构建新一代酿酒酵母的工业菌株是有用的，该方法特征 在于来自常规（葡萄糖、蔗糖）和非常规（木质纤维素）原料的改进的乙醇产率。
[0007] 在本申请中，我们描述了通过过表达编码碱性磷酸酶的完整或截短形式的酿酒酵 母PH08基因来降低细胞ATP的另一种方法。 发明概述
[0008] 在一个通用实施例中，本发明提供了一种酿酒酵母菌株，该菌株包括一个编码一 种碱性磷酸酶的核酸序列，该核酸序列可操作地连接至一个启动子、在该细胞中表达该碱 性磷酸酶。在某些更具体的实施例中，由该核酸序列表达的碱性磷酸酶的菌株包含一个液 泡靶向序列并且该碱性磷酸酶存在于该细胞的液泡中。在其他独特实施例中，该碱性磷酸 酶缺少一个液泡靶向序列并且碱性磷酸酶存在于该细胞的细胞质中。
[0009] 在最有用的实施例中，该菌株相对于缺少该编码碱性磷酸酶的核酸序列的亲本细 胞在细胞中过表达碱性磷酸酶。在某些过表达的实施例中，该细胞包含编码一种碱性磷酸 酶的核酸序列的多个拷贝，该核酸序列可操作地连接至一个启动子、在该细胞中表达该碱 性磷酸酶。在一些具体的实施例中，编码一种碱性磷酸酶、可操作地连接至一个启动子、在 该细胞中表达该碱性磷酸酶的核酸序列被整合到该细胞的基因组中。
[0010] 在特别有用的实施例中，用于过表达该碱性磷酸酶活性的启动子是一个来自酿酒 酵母的乙醇诱导型启动子。在示例性实施例中，该诱导型启动子是一个醇脱氢酶启动子。
[0011] 最有用的实施例的菌株的特征为在厌氧发酵期间的过程中比一种缺少编码该碱 性磷酸酶、可操作地连接至一个启动子、表达该碱性磷酸酶的核酸序列的亲本菌株产生更 高效价的乙醇。再者，最有用的菌株进一步地其特征为在厌氧发酵期间的过程中比一种缺 少编码该碱性磷酸酶、可操作地连接至一个启动子、表达该碱性磷酸酶的核酸序列的亲本 菌株具有减少的生物质积累速率。
[0012] 在一个相关的方面中，提供了一种生产乙醇的方法，该方法包括在厌氧生长条件 下生长上述菌株的至少一种持续足够产生乙醇的一段时间。 附图简要说明
[0013] 图 1 质粒 pUC57- δ l_2-ADHpr-CYCt-kanMX (A)、pUC57- δ l_2-ADHpr-PH08-CYCt-k anMX (B)的线性方案。δ 1、δ2 - δ元件-酵母菌逆转录转座子Tyl的长末端重复序列； ADHl pr-编码醇脱氢酶的基因的启动子；CYCl term-细胞色素 C基因的终止子；kanMX4-对 抗生素遗传霉素提供抗性的基因；PH08 -编码碱性磷酸酶的完整的ORF。
[0014] 图 2 质粒 pUC57- δ l_2-ADHpr-PH08_trunc-CYCt-kanMX (A)、 pUC57-δ l_2-ADHpr-MATa sign.-PH08_trunc-CYCt-kanMX(B)、 pUC57-Sl_2-ADHpr-PH05sign.-PH08_trunc-CYCt-kanMX(C)的线性方案。PH08_ trunc-编码截短形式的碱性磷酸酶的基因，该基因缺少负责跨膜蛋白递送的60个初始 氨基酸以及由通常从在细胞液泡中的蛋白质裂解的C末端前肽组成的22个末端氨基酸； MAT a sign. -PH08_trunc-编码截短形式的碱性磷酸酶的基因，该基因具有代替它的自然递 送信号的来自交配信息素 a因子（MF1 α )的细胞外输出信号；PH05sign. -PH08_trunc -编 码截短形式的碱性磷酸酶的基因，该基因具有来自酸性磷酸酶（PH05)的细胞外输出信号。
[0015] 图 3 携带质粒 pUC57- δ l_2-ADHpr-PH08-CYCt-kanMX. BY4742 -受体菌株的菌株 的无细胞提取物的特异性碱性磷酸酶活性（以纳摩尔的产物/mg的蛋白*分钟计）。
[0016] 图4由斑点杂交估计整合的表达盒的拷贝数。顶行示出了野生型菌株、BY4742、 PH08的1个拷贝，剩余的行示出了包含载体pUC57- δ l_2-ADHpr-PH08-CYCt-kanMX的重组 菌株。该基因组中的PH08基因的从2至8-10个拷贝。
[0017] 图5表达盒整合模式的分析。A)DNA杂交使用PH08基因作为探针。HindIII被用 于基因组DNA限制B)载体整合的"头接尾（head-to-tale)"构象。
[0018] 图 6 携带质粒 pUC57- δ l_2-ADHpr-PH08-CYCt-kanMX. BY4742 -受体菌株的菌株 的生长动力学。
[0019] 图 7 携带载体 pUC57- δ l_2-ADHpr-PH08-CYCt-kanMX. AS400 -受体菌株的重组菌 株的特异性碱性磷酸酶活性（以纳摩尔的产物/mg的蛋白*分钟计）。
[0020] 图 8 携带载体 pUC57- δ l_2-ADHpr-PH08-CYCt-kanMX. AS400 -受体菌株的菌株的 在细胞中的ATP水平（以微摩尔的ATP/mg的干细胞重量计）。
[0021] 图9以纳摩尔的产物/mg的蛋白*分钟计的特异性碱性磷酸酶活性。BY4742 - WT，受体菌株。BY+PH08 2 ;5 -包含载体 pUC57- δ l_2-ADHpr-PH08-CYCt-kanMX 的菌株。 BY+PH08 truncl ;5 ;9 -包含载体 pUC57- δ l_2-ADHpr-PH08_trunc-CYCt-kanMX 的菌株。 具有 MATa 1 ;2 ;3 的 BY+PH08 trunc -包含载体 pUC57- δ l_2-ADHpr-MAT a sign. -PH08_ trunc-CYCt-kanMX 的菌株。具有 PH05 I ;2 ;3 的 BY+PH08 trunc -包含载体 pUC57- δ l_2-ADHpr-PH05sign. -PH08_trunc-CYCt-kanMX 的菌株。A-培养 1 天；B-培养 2 天。
[0022] 图10野生型菌株BY4742及其衍生物的生长动力学，这些衍生物包含用于完整的 (BY+PH082 ;5)或改性的（BY+PH08 truncl ;5 ;9 ;具有 MATa 1 ;2 ;3 的 BY+PH08 trunc ;具有 PH05 1 ;2 ;3的BY+PH08 trunc)形式的PH08基因的表达盒。
[0023] 图11在酒精发酵过程中通过野生