了制备溶液1，将200-280g麦芽糖糊精与800ml水混合并且将pH调节到6. 0。 添加 α淀粉酶（在〇· 1单元的液化酶（Liquizyme) SCDS/克麦芽糖糊精的速率下）用于与 该混合物液化，将其加热至80°C并且将样品保持30分钟。
[0035] 为了制备溶液2,将63ml的CSL浓缩物（包含约50%的干固体）与137ml去离子 水混合。接着将溶液1和2高压灭菌、冷却、合并并且混合。将葡糖淀粉酶的一个等分部分 (在0. 2单元葡糖淀粉酶/克麦芽糖糊精的速率下）添加至无菌烧瓶中并且在28°C下孵育 这些烧瓶。在酵母菌接种之前确定葡萄糖浓度。 结果
[0036] 完整形式的碱性磷酸酶的克隆和过表达。由基因 PH08编码的酿酒酵母非特异性 碱性磷酸酶在不同的包括ATP的化合物中催化二磷酸键的水解（Kaneko等人，1982)。因 此这种酶可作为其他ATP酶起作用。为了在细胞中进行二磷酸键的水解，这种酶的活性需 要是相当高的。这种克隆的酶在酿酒酵母细胞中的活性取决于很多因素，在它们之中，所选 择的启动子的强度、所产生的mRNA的稳定性、缺少翻译后的酶抑制、以及整合至宿主基因 组的该基因的拷贝数。我们已经证明了编码醇脱氢酶的基因的ADHl启动子在酒精发酵的 条件下提供了靶基因的诱导型表达（Sibirny等人，2011)。我们决定使用这种启动子用于 PH08基因表达。为了得到整合至该酵母菌基因组中的PH08基因的更高拷贝数，构建一种包 含δ序列的整合质粒。该酿酒酵母δ序列是逆转录转座子Tyl和Ty2的长末端重复序列。 总数为约425的δ序列典型地分散遍及酵母菌基因组。示出了使用基于δ序列的载体通 过同源重组可以提供整合至酵母菌基因组DNA的一个或几个位点中的串联多拷贝（Lee和 Da Silva，1997)。如在材料与方法中描述的构建在ADH启动子的控制下的携带PH08基因 的基于S序列的质粒并且随后将其转化为酿酒酵母实验室菌株BY4742。
[0037] 测定所选择的重组菌株的特异性碱性磷酸酶的活性。在11个所测试的转化体之 中，六个菌株的特征为相当高的特异性磷酸酶活性（图3,菌株1-5和11)。在这些菌株中， 当与初始的宿主菌株BY4742相比时，碱性磷酸酶的特异性活性是高30-40倍。因此，这种 构建的表达载体可被用于有效多拷贝整合至酵母属宿主的基因组中。
[0038] 将从这些重组菌株分离的基因组DNA制品经受斑点杂交以估计携带整合至该基 因组中的靶基因的质粒拷贝数。使用基因 PH08作为探针（图4)。揭示了包含从1至7-9 个另外的PH08基因拷贝的重组菌株。观察到在PH08基因的拷贝数目与特异性碱性磷酸酶 的活性之间的良好的相关性。
[0039] 进行DNA杂交以分析所测试菌株的载体整合模式（图5，A)。来自WT和重组菌株 的总基因组DNA被HindIII消化并且用一个标记的PH08基因杂交。示出了所构建的基于 S序列的载体提供了在所谓的"头接尾"构象中整合至酵母菌基因组DNA的高达三个位点 中的串联多拷贝（图5, B)，这与公布的结果（Lee和Da Silva，1997) -致。
[0040] 出人意料地，几种所选择的重组菌株揭示了受损的生物质积累，这与增加的碱性 磷酸酶活性水平不相关（图6)。
[0041]质粒 pUC57- δ l_2-ADHpr-PH08-CYCt-kanMX 被用于转化工业菌株 AS400。与亲 本菌株AS400相比，所选择的转化体具有至多5. 5倍的碱性磷酸酶特异性活性的增加（图 7)。将具有最高碱性磷酸酶特异性活性的重组菌株在一种补充有水解的玉米粗粉的CSL培 养基上经受针对酒精发酵效率的测试。与亲本菌株（79. lg/L)相比，菌株AS400+PH08-6、 AS400+PH08-8、AS400+PH08-3B、AS400+PH08-12 产生了 增加的乙醇量（84. 4、86· 5、84· 4、 90. lg/L)(表1)。一些所分析的重组菌株比野生型菌株AS400具有轻微降低的细胞内ATP 水平（图8)。 表1 具有脱阻抑的PH08 (碱性磷酸酶）的酿酒酵母重组菌株和初始菌株AS400在补充有水 解的玉米面的CSL培养基上在酒精发酵的第一天的乙醇合成。
[0042] 截短形式的碱性磷酸酶的克隆和过表达。如在此描述的，一些携带质粒 PUC57- δ l_2-ADHpr-PH08-CYCt-kanMX的重组菌株具有高达30倍的碱性磷酸酶活性增加， 但是它们的生长水平实质上与WT菌株的生长水平没有不同。这个结果可以通过能够阻碍 ATP水解的碱性磷酸酶的液泡定位解释。为了测试，我们决定构建包含编码截短形式的碱性 磷酸酶的基因的菌株，该碱性磷酸酶将保持在细胞质中而不是被递送至液泡中。然而，存在 阻止阻塞活性细胞溶质形式的碱性磷酸酶的产生的几个缺点。首先，示出了碱性磷酸酶作 为一种包含C末端前肽的无活性前体被合成，该C末端前肽然后以一种PEP4依赖的方式从 在液泡中的蛋白质裂解（Klionsky D.和Emr S.D. 1989)。在液泡的递送（其与分泌途径 具有相同的早期阶段）过程中，前体形式的这种酶在内质网中被糖基化。还已经示出了活 性形式的碱性磷酸酶在液泡中而不是在分泌途径的较早的区室中接受它的金属辅因子锌 (Qiao W.等人1985)。为了估计这些因素如何影响这种酶的活性，我们决定生产几种截短 形式的碱性磷酸酶。该第一种形式缺少负责跨膜蛋白递送的60个初始氨基酸以及合成通 常从液泡中的蛋白质裂解的C末端前肽的22个末端氨基酸。该第二种形式具有一个代替 它的自然递送信号的来自交配信息素 a因子（MF1 α )的细胞外输出信号，并且，最终，所构 建的第三种形式具有一个来自酸性磷酸酶（基因 ΡΗ05)的细胞外输出信号。
[0043] 包含三种提及的ΡΗ08改性形式（部分具有选择标记（侧接δ序列））的表达盒 的DNA片段被用于转化酿酒酵母菌株ΒΥ4742。在通过PCR转化之后确认了这些表达盒的存 在。
[0044]测定所获得的重组菌株的特异性碱性磷酸酶的活性并且与具有完整形式的ΡΗ08 的转化体的活性进行比较。在包含质粒PUC57- δ l_2-ADHpr-PH08_trunc-CYCt-kanMX的菌 株中的细胞内碱性磷酸酶活性与在具有完整形式PH08的菌株中的处于相同的水平。在包 含质粒 PUC57- δ l_2-ADHpr-MAT a sign. -PH08_trunc-CYCt-kanMX 的菌株中的细胞内碱性 磷酸酶活性是非常低的，几乎与在WT菌株中的处于相同的水平。最可能，这种形式的碱性 磷酸酶从细胞中分泌。包含质粒 PUC57- δ l_2-ADHpr-PH05sign. -PH08_trunc-CYCt-kanMX 的菌株的细胞内碱性磷酸酶活性在培养的第一天是高的。这个活性在培养的第二天降低并 且这可以通过分泌形式的碱性磷酸酶输出的延迟进行解释。（图9A，B)。
[0045] 测试所构建的重组体的生长动力学。具有不同截短PH08形式的几乎所有菌株在 培养的第一天生长已经受损并且到培养的第二天生长受损降低至较小的程度（图10)。这 些重组菌株尤其是具有截短形式的碱性磷酸酶的那些，它们保持在细胞的细胞质中，还显 著地生产更少的乙醇（图11)。这表明了细胞溶质形式的碱性磷酸酶还有力地影响其他细 胞磷酸化的化合物的水平，这些化合物影响所有代谢途径，尤其负责酒精发酵的反应。
[0046] 总之并且在这项工作的基础上，完整的液泡形式的碱性磷酸酶适合于在酿酒酵母 细胞中获得更高的乙醇。 参考文献
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