分离的植物防御素多肽及其制备方法和在治疗肺癌中的用图
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物制药领域，具体地，涉及分离的植物防御素多肽及其制备方法和 在治疗肺癌中的用途，更具体地，涉及植物防御素多肽及其制备方法、分离的寡核苷酸、构 建体、重组细胞、分离的植物防御素多肽在制备药物中的用途及药物。
【背景技术】
[0002] 防御素是存在于动植物体内、富含半胱氨酸的阳离子小蛋白或多肽。作为动植物 体内具有防御和保护功能的多肽，防御素具有广谱抗细菌、抗真菌和杀死很多带囊膜和不 带囊膜病毒的生物学功能。防御素一般是由18-50个氨基酸组成，含有6-8个保守的半胱 氨酸，形成3-4个二硫键，并具有一定化学稳定性结构的多肽物质。
[0003] 研究发现，动植物的免疫细胞，如粒细胞和所有的上皮细胞，具有多种可以帮助杀 死病原微生物的防御素存在，其作用机理首先是利用防御素的阳离子与细胞膜上负电荷相 互作用而附着于细菌膜表面、通过与细胞膜脂质双层中蛋白间的相互作用、嵌入到细菌细 胞膜中、形成离子通道或特殊的孔道，破坏其完整性并造成穿孔和细胞内离子和营养物溢 出胞外而导致细菌的死亡。
[0004] 目前，从动植物分离到的防御素种类多，分布广泛，从植物、昆虫、软体动物、甲壳 动物、两栖动物、鱼类、鸟类及哺乳动物等生物均有发现。对不同来源防御素的作用范围，尚 未有系统和深入的研究。特别是植物防御素在抗肿瘤药物方面的研究很少，尤其是在人类 癌症药物的研究上，几乎还是空白。
[0005] 因而，关于植物防御素的研究仍有待深入。
【发明内容】
[0006] 本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明的 一个目的在于提出一种能够有效抑制肿瘤细胞增殖的手段。
[0007] 在本发明的第一方面，本发明提供了一种分离的植物防御素多肽。根据本发明的 实施例，该分离的植物防御素多肽具有SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列。发明人发现，本发 明的分离的植物防御素多肽能够有效抑制肺癌细胞生长，进而能够预防或治疗肺癌。
[0008] 在本发明的第二方面，本发明提供了一种分离的寡核苷酸。根据本发明的实施例， 该分离的寡核苷酸具有SEQ ID NO :2所示的核苷酸序列。根据本发明的实施例，所述分离 的寡核苷酸编码前面所述的分离的植物防御素多肽。
[0009] 在本发明的第三方面，本发明提供了一种从植物坚果中分离获得前面所述的分离 的植物防御素多肽的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：（1)将所述植物坚果果仁预 冷后粉碎，然后进行酒精浸泡处理；（2)将经过酒精浸泡处理的果仁依次进行第一过滤、酒 精浸洗和干燥处理，以便获得干燥的果仁粉末；（3)将所述干燥的果仁粉末依次进行硫酸 浸泡干燥处理和第一离心处理，以便收获上清液；（4)将所述上清液依次进行MES缓冲液调 节、第二离心和第二过滤处理，以便获得离子交换层析样品；以及（5)将所述离子交换层析 样品进行离子交换柱层析分离，以便获得所述分离的植物防御素多肽。发明人发现，利用本 发明的该方法，能够快速有效地获得前面所述的分离的植物防御素多肽，且方法简单，操作 方便，对设备无特殊要求，易于实现，并且获得的多肽纯度较高，能够有效用于预防或治疗 肺癌。
[0010] 根据本发明的一个实施例，从植物坚果中分离获得前面所述的分离的植物防御素 多肽的方法包括：（1)将所述植物坚果果仁预冷后粉碎，并用100%酒精浸泡4小时；（2)将 经过酒精浸泡处理的果仁依次进行第一过滤、100%酒精浸洗和干燥处理，以便获得干燥的 果仁粉末；（3)利用0. 05M的硫酸浸泡所述干燥的果仁粉末2小时，离心、收获上清液；（4) 利用MES缓冲液调节所述上清液至20mM，并于13500rpm下进行第二离心30分钟后，利用 0. 45 μ m滤膜进行第二过滤处理，以便获得离子交换层析样品；以及（5)将所述离子交换层 析样品进行离子交换柱层析分离，以便获得所述分离的植物防御素多肽。由此，能够有效获 得前面所述的分离的植物防御素多肽，且获得的多肽品质良好，产率较高。
[0011] 根据本发明的实施例，步骤（5)中将所述离子交换层析样品进行离子交换柱层析 分离进一步包括：（5-1)将所述离子交换层析样品进行离子交换柱层析分离，然后用20mM MES缓冲液洗脱，其中所述离子交换柱包括C8硅胶柱和反向C2/C18硅胶柱；（5-2)依次利 用含有0. 1%三氟乙酸的5%的乙腈和含有0. 1%三氟乙酸的50%乙腈对所述C8硅胶柱进行 第一洗脱处理，以便获得第一洗脱样品；（5-3)于4摄氏度下，将所述第一洗脱样品进行第 一真空干燥浓缩，并将经过第一真空干燥浓缩的样品溶解于含有0. 1%三氟乙酸的5%乙腈 中，以便获得溶解样品；（5-4)将所述溶解样品上样至所述反向C2/C18硅胶柱上，并依次利 用含有0. 1%三氟乙酸的5%的乙腈和含有0. 1%三氟乙酸的50%乙腈对所述C8硅胶柱进行 第二洗脱处理，以便获得第二洗脱样品；（5-5)于4摄氏度下，将所述第二洗脱样品进行第 二真空干燥浓缩，并将经过第二真空干燥浓缩的样品溶解于水中反复抽提，以便获得所述 分离的植物防御素多肽。由此，能够获得的前面所述分离的植物防御素多肽的纯度较高。
[0012] 根据本发明的实施例，所述植物坚果为南洋杉坚果。由此，前面所述分离的植物防 御素多肽的产率较高。
[0013] 在本发明的第四方面，本发明提供了一种构建体。根据本发明的实施例，该构建体 包含前面所述的分离的寡核苷酸。利用本发明的构建体可以有效转化重组细胞，并且通过 培养转化获得的重组细胞能够快速有效地制备前面所述的分离的植物防御素多肽。
[0014] 在本发明的第五方面，本发明提供了一种重组细胞。根据本发明的实施例，该重组 细胞包含前面所述的构建体。根据本发明的实施例，所述重组细胞为酵母细胞。
[0015] 在本发明的第六方面，本发明提供了一种制备前面所述分离的植物防御素多肽的 方法。根据本发明的实施例，该方法包括：将前面所述的重组细胞接种至氨基酸缺陷型液体 培养基，进行发酵罐深层通气培养80-100小时，以便获得发酵液；将所述发酵液进行分离 纯化，以便获得所述分离的植物防御素多肽。发明人发现，利用本发明的该方法，能够有效 制备所述分离的植物防御素多肽，且该方法操作简单，方便快捷，容易控制，易于实现规模 化生产。
[0016] 根据本发明的实施例，进行所述培养96小时。由此，有利于提高所述分离的植物 防御素多肽的产率。
[0017] 根据本发明的实施例，所述分离纯化包括：将所述发酵液进行分离处理，以便获得 去除菌体的发酵液；将所述去除菌体的发酵液进行第一纳滤浓缩处理，以便获得第一浓缩 液；将所述第一浓缩液进行加热处理，以便获得经过加热处理的第一浓缩液；将所述经过 加热处理的第一浓缩液进行离心处理，以便获得经过离心的第一浓缩液；将所述经过离心 的第一浓缩液进行凝胶柱分离，以便获得经过分离的第一浓缩液；将所述经过分离的第一 浓缩液进行第二纳滤浓缩处理，以便获得第二浓缩液；将所述第二浓缩液进行冷冻干燥，以 便获得所述分离的植物防御素多肽。由此，能够有效获得所述分离的植物防御素多肽，且获 得的多肽纯度和产率较高。
[0018] 在本发明的第七方面，本发明提供了前面所述的分离的植物防御素多肽在制备药 物中的用途，所述药物用于治疗肺癌。
[0019] 在本发明的第八方面，本发明提供了一种药物。根据本发明的实施例，该药物包含 前面所述的分离的植物防御素多肽。根据本发明的实施例，所述药物用于治疗肺癌。
【附图说明】
[0020] 图1显示了根据本发明的一个实施例，植物防御素 BaMPl的质谱图；
[0021] 图2显示了根据本发明的一个实施例，重组克隆载体pVD5_BaMPl的构建流程图；
[0022] 图3显示了根据本发明的一个实施例，表达载体PTG3828_BaMPl的构建流程图；
【具体实施方式】
[0023] 下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发 明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文 献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均 为可以通过市购获得的常规产品。
[0024] 在本发明的描述中，术语"第一"、"第二"仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗 示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有"第一"、"第二"的特 征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。在本发明的描述中，"多个"的含义是 两个或两个以上，除非另有明确具体的限定。
[0025] 在本发明的第一方面，本发明提供了一种分离的植物防御素多肽。根据本发明的 实施例，该分离的植物防御素多肽具有SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列。发明人发现，本发 明的分离的植物防御素多肽能够有效抑制肺癌细胞生长，进而能够预防或治疗肺癌。
[0026] 在本发明的第二方面，本发明提供了一种分离的寡核苷酸。根据本发明的实施例， 该分离的寡核苷酸具有SEQ ID NO :2所示的核苷酸序列。根据本发明的实施例，所述分离 的寡核苷酸编码前面所述的分离的植物防御素多肽。
[0027] 在本发明的第三方面，本发明提供了一种从植物坚果中分离获得