，具 体如下：
[0060] (1 )、分别将植物防御素 BaMP 1基因和克隆载体PVD5进行核酸限制性内切酶（Hind III/BamH I)酶切并线性化后，施行第一次连接反应。具体步骤如下：将500纳克、经Hind III/BamH I线性化的克隆载体pVD5与2微克、经Hind III/BamH I酶切处理的BaMPl基 因混合，同时，加入2微升10倍的T4DNA连接酶缓冲液、2微升T4DNA连接酶、和2微升50% 的PEG4000溶液，然后加入无核酸酶的纯净水至2微升(所有连接酶和溶液均从Fermentas Life Sciences公司购买)。链接反应在4摄氏度培育12小时后，进行ToplO感受态细胞的 转染试验，ToplO感受态细胞。相关感受态细胞转染实验的程序、以及利用氨苄青霉素筛选 菌落，并获得重组克隆载体pVD5-BaMPl的操作程序是以"分子克隆实验指南"（第三版）的 相关试验方法。重组克隆载体pVD5-BaMPl的构建流程图见图2。
[0061] (2)、将上述获得的重组克隆载体pVD5_BaMPl利用核酸限制性内切酶（Sal I和 BamHI)双酶切，以便释放分别含有位于目的基因上游的酵母菌配对因子的启动子、植物防 御素 BaMPl基因和位于目的基因下游的两个表达终止位点（TAATAG)的基因族群，并利用核 酸限制性内切酶（Sal I/Bgl II)线性化处理表达载体PTG3828质粒，以便获得线性化的表 达载体PTG3828片段；
[0062] (3)、关于目的基因族群经Sal I和BamH I的双酶切、表达载体PTG3828的线性 化、目的基因与线性化表达载体的酶连反应，重组菌落的抗生素抗性筛选和克隆等所有操 作程序和方法均参照"分子克隆实验指南"（第三版）的相关试验方法。重组的表达载体 PTG3828-BaMPl的构建流程图见图3。
[0063] 经核酸序列分析，确认重组的表达载体PTG3828构建正确。其中，在重组的表达 载体PTG3828-BaMPl中，含有细胞蛋白酶特异性识别位点，因此目的基因在完成基因表达 时，其表达产物自动被细胞内蛋白酶所切割、释放，形成分泌型产物，释放成熟的蛋白质，并 可通过分泌小泡、经内质网和高尔基复合体等微管系统、运输到质膜（PM)，从质膜分泌到胞 外。
[0064] 实施例5 :酵母细胞的转化
[0065] 将实施例4构建的重组表达载体PTG3828-BaMPl、IOmg鱼精DNA和经LiCl处 理制备的 C13BYS86 酵母感受态细胞（Kunze I.et al·，Biochemica et Biophysica Acta(1999) 1410:287-298)充分混匀后，于28°C静置培育12小时，然后使用氨基酸缺陷型 选择培养基（SD Medium从BIOlOlSystems公司购买)平板筛选重组酵母菌落。只有成功转 化的C13BYS86细胞才能形成菌落，由此获得转化酵母菌。
[0066] 实施例6 :生物学活性检测
[0067] 挑取实施例5中获得的转化酵母菌菌落，利用液体Yro培养基（1%酵母膏，2%蛋白 胨，2%葡萄糖)，于28°C~30°C下，摇瓶培养70小时，然后将培养产物于3000rpm下离心，取 上清液，并进行生物学活性检测。具体如下：
[0068] 将等量转化酵母菌的培养上清与1000个菌落形成单位的大肠杆菌E. coli (100 微升+100微升)混合，于37°C培育6小时后，接种LB固体培养基（0. 5%酵母膏，1%蛋白胨， l%NaCl，2%琼脂粉)，然后于37°C培养箱中培养12小时。同时设置未接菌YH)培养液与1000 个菌落形成单位的大肠杆菌E. coli混合的阳性对照。实验结果表明，与未接菌YH)培养液 相比，转化酵母菌的培养上清菌落明显减少，表明有分泌性植物防御素 BaMPl产生。
[0069] 实施例7 :色质联用分析
[0070] 将实施例6中证明有明显抑菌效果的转化酵母菌的培养上清进行质谱分析，并同 时利用核酸序列分析和氨基酸序列的分子量测算进行比对，如果质谱特征条件和多肽分子 量与氨基酸序列分子量的测算相符合，则证明载体构建和酵母转化成功。纯化的BaMPl的 质谱分析图谱见图1。在对有明显抑菌效果的转化酵母菌的培养上清进行质谱分析时，出现 了分子量分别为4802、4818、和4838g/mol的三个吸收峰，但是，4802g/mol的吸收峰为最主 要的吸收峰；在同时使用ChinaPeptides Co.，Ltd的多肽计算器对克隆的BaMPl核酸翻译 后的多肽的分子量进行测算时，该43个氨基酸组成的多肽的分子量为：4734. 37g/mol，该 测算结果与质谱分析中最主要的4802g/mol吸收峰的分子量最为接近，其差异可能是因为 不同测算方法的差别。
[0071] 实施例8 :转化体的培养
[0072] 将实施例5中获得的转化酵母菌接种到氨基酸缺陷性液体培养基（（SD Medium从 BIOlOlSystems公司购买)），在标准发酵罐深层通气培养，培养时间为96小时，然后，将得 到的发酵液采用陶瓷膜分离掉菌体，接着将分离掉菌体的发酵液纳滤浓缩到蛋白质含量在 5%左右，随后加热到80摄氏度，并保持20分钟，再冷却到20摄氏度，然后1000 Orpm离心 30min分离去杂，向所得产物中添加10倍量pH为5的盐酸溶液稀释，使蛋白质含量0. 5% 左右，过DEAE凝胶柱后，纳滤浓缩蛋白质含量在5%左右，冻干，得到纯化产物，产物纯度为 95%，纯化产物与折干的培养基质量相比，产率为0. 2%左右，其中，产率={(发酵液表达产物 总质量X纳滤浓缩收率X去杂收率XDEAE凝胶分离收率X浓缩收率X冻干收率）/折 干的培养基总质量）X 100%。
[0073] 实施例9 :植物防御素 BaMPl抗肺癌细胞体外试验
[0074] 实验材料：
[0075] 受试细胞：人肺癌A-549, NCI-460,95-D (中国药科大学)，人正常肺上皮细胞 BEAS-2B (ATCC)。
[0076] 仪器：超净工作台，恒温CO2培养箱(德国heraeus)，酶联免疫检测仪（Bio-RAD)， 倒置生物显微镜（Olympus)
[0077] 试剂：RPMT1640(GIBC0)，DMEM培养基（GIBCO)，胰蛋白酶（SIGMA)，新生牛血清，噻 唑兰（MTT )，二甲基亚枫（DMSO )。
[0078] 实验方法：
[0079] 步骤l.取指数生长期的受试细胞A-549，NCI-460,95-D，BEAS-2B，分别加入0.25% 胰蛋白酶消化液，使贴壁细胞脱落，计数，配成2~4X IO4个/ml的细胞悬液。
[0080] 步骤2.取步骤1中得到的细胞悬液接种于96孔板上，每孔180 μ 1，每种细胞3个 处理，置于恒温CO2培养箱中，于温度为36. 5°C士 0. 5°C下培养24小时。
[0081] 步骤3.将实施例8中获得的纯化产物用2N盐酸溶解，制成20mg/ml的植物防御 素 BaMPl溶液，然后经过培养的孔板中加入配好的植物防御素 BaMPl溶液，加入量使得每种 细胞的3个处理间植物防御素 BaMPl的终浓度分别为6. 66 μ g/ml，66. 66 μ g/ml和200 μ g/ ml，置于恒温CO2培养箱中，于温度为36. 5 °C 士 0. 5 °C下培养48小时，其中，受试细胞Α-549， NCI-460,95-D为药敏组，受试细胞BEAS-2B为阴性对照组。
[0082] 步骤4.每孔加入ΜΤΤ20 μ 1，置于恒温CO2培养箱中，于温度为36. 5°C 士 0. 5°C下 反应4小时。
[0083] 步骤5.吸弃上清液，加入DMS0150 μ 1/孔，平板摇床上震荡5分钟。
[0084] 步骤6.用酶联免疫检测仪在波长为570nm处测定每孔的OD值，并计算植物防御 素 BaMP 1对不同肺癌细胞的抑制率。抑制率是以被测定细胞的受抑制的百分比（％)所表示。 其中，
[0085] 细胞抑制率％=(阴性对照组OD值-药敏组OD值/阴性对照组OD值）X 100%。 测定结果见表1 「00861 表1棺物防御素 BaMPl对肺癌细朐的抑制率
[0088] 表1的结果说明，本发明提供的植物防御素 BaMPl对三种不同的人肺癌细胞系 (A-549、NCI-460、95-D)有显著抑制作用，且抑制率与植物防御素 BaMPl的浓度呈正相关。
[0089] 实施例10 :植物防御素 BaMPl对小鼠 S180肉瘤的抑制试验
[0090] 实验动物：取35-40日龄、体重18-20g的清洁级雄性ICR小鼠(上海斯莱克实验动 物有限公司，实验动物生产许可证：SCXK (沪）2007-0005) 35只，取含有生长旺盛期的S180 肉瘤细胞腹水，在无菌条件下制备成浓度为5X IO7个/ml的细胞悬液，以0. 2ml/只的剂量 接种于ICR小鼠右侧腋窝皮下，接种第二天将ICR小鼠随机分为5组，每组7只，其中，包括 一个空白对照组，一个阳性对照组，三个实验组。
[0091] 受试药物及配制方法：
[0092] 将实施例8中获得的纯化产物，用无菌生理盐水溶解，配制成浓度为2mg/ml的澄 清透明的溶液，给药剂量分别为l〇〇mg/kg、50m