还原敏感性聚乙烯亚胺衍生物,其制备方法及应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物医学材料领域，涉及一种聚合物载体材料，具体涉及还原敏感性 聚乙烯亚胺衍生物，其制备方法及应用。
【背景技术】
[0002] 核酸治疗是治疗多种先天和后天疾病的一种有力工具，但是如何实现核酸药物安 全有效的体内递送是核酸治疗的一大技术瓶颈。在众多核酸递送载体中，聚乙烯亚胺（PEI) 由于具有较高的电荷密度(有效固缩核酸）和独特的胞内转运机制(胞内溶酶体逃逸）而被 广泛研究。分子量为25KDa的分枝状PEI和In vivo jetPEI?(分子量为22KDa的直线型 PEI)分别被认为是体外核酸递送和体内核酸递送的金标准。然而，未经化学改性的PEI存 在转染活性-毒性的相互制约关系，即PEI分子量越大，转染活性越高，但同时毒性也越大。
[0003] 为了平衡聚乙烯亚胺的毒性和转染活性，现在多采用结构修饰的方法对聚 乙烯亚胺进行化学改性，如采用PLGA、肝素、透明质酸、PEG等对高分子量聚乙烯亚胺 进行化学改性（参见 Chumakova 0V, et al, Cancer Lett. 2008; 261 (2):215-225; Jeon 0, et al, J. Control. Release 2008 ; 132 (3) : 236-242 ; Jiang G, et al,Mol. Pharm. 2009; 6 (3) : 727-737; Merkel 0M, et al, Mol. Pharm. 2009; 6 (4) : 1246-1260)，提高其 转染活性的同时降低毒性。中国专利号CN101704949A公开了名称为"丙烯酰胺类单体修 饰的聚乙烯亚胺、制法和在基因传递中的应用"，该专利对分子量为25K的分枝状PEI修饰 后，不仅提高了转染效率，而且大大降低了毒性。中国专利号CN102181053A公开了名称为 "一种疏水基团修饰的聚乙烯亚胺衍生物及其应用"的发明专利，该专利提供了一种酸敏感 疏水改性的聚乙烯亚胺(分子量为9. 5K-10. 5K)，该修饰方法增强了 PEI与DNA的复合能力， 且材料细胞毒性较低。
[0004] 另外，采用交联剂将无细胞毒性的小分子量PEI交联形成二硫键、酯键、胺酯键、 亚胺键连接的可降解PEI，交联后的小分子量PEI具有比母体PEI大大增强的核算递送效 能，且交联的化学键在一定条件下水解或酶解，可降解为无细胞毒性的小分子量PEI，安全 性高。最早俄亥俄州立大学的Robert J. Lee课题组用交联剂二硫代双(琥珀酰亚胺基丙酸 酯）DSP、二硫二丙二亚氨甲基醚（DTBP)分别与小分子量PEI (PEI800Da)交联得到DSP-PEI 和DTBP-PEI，DSP-PEI和DTBP-PEI在中国仓鼠卵巢癌细胞（CHO)中具有与市售高分子量 b-PEI25K 相当的转染活性（参见 Gosselin MA, et al, Bioconjug. Chem. 2001，12:989-94)。 德国的Manfred Ogris同样用DSP、DTBP、1, 6己二醇二丙烯酸酯分别与小分子量的聚胺 (亚精胺、精胺、三乙撑四胺、四乙撑五胺、五乙撑六胺、PEISOODa)交联，得到二硫键交联的 IP-Iinked、SP-Linked，酯键交联的HD-Linked三类共计37个水溶性聚阳离子，其中酯键交 联PEI800的0EI-HD-1的转染活性好于市售直线型PEI22K Da阳性对照（参见Kloeckner J, et al, Eur. J. Pharm. Sci. 2006;29:414-25.)。中国专利号 CN201110312946. 8 公开了名 称为"一种氨酯键交联的聚乙烯亚胺类聚阳离子载体制备工艺"的发明专利，该发明专利提 供了一种由1，4-丁二醇氯甲酸酯交联得到的高效、低毒的氨酯键交联的小分子量PEI。中 国专利号CN200610097858. X公开了名称为"可生物降解的交联聚乙烯亚胺及其应用"的发 明专利，该发明专利采用各种二酸的缩水甘油酯、丙烯酸/甲基丙烯酸缩水甘油酯或各种 多元醇或多元缩醇的丙烯酸/甲基丙烯酸的多元酯中的一种或几种复合物为交联剂交联 各种分子量的PEI，实现了对C6、MCF-7、3T3、A375、EL4、Hela、F10、A549等细胞高效、低毒 的转染。
[0005] 经专利查询及文献检索，目前国内外还没有将疏水修饰和交联剂交联两种方法同 时应用来对聚乙烯亚胺进行改性以平衡其转染活性和毒性的报道。
【发明内容】
[0006] 本发明要解决的技术问题是提供一种还原敏感性聚乙烯亚胺衍生物，其在体内外 的稳定性要好，转染效率高，且细胞毒性小。
[0007] 此外，还需要提供一种还原敏感性聚乙烯亚胺衍生物的制备方法及其作为核酸载 体的应用。
[0008] 为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现：
[0009] 在本发明的一个方面，提供了还原敏感性聚乙烯亚胺衍生物，其化学组成式为 (R1-PEI) X-SS- (PEI-R2) y，化学组成式中两个PEI可以均为直线型PEI，或者均为分枝状PEI， 或者一个为直线型PEI，一个为分枝状PEI，-SS-为二硫键，R 1和R2各自独立选择为通式为 H-(CH2) η-的基团，η选自0-14中的任意整数；其结构式为：
[0010]
[0011] 组成式和结构式中，X和y表示重复单元的个数,且x=l-120，y=l-120 各自 独立选择为通式为H-(CH2)n-的基团，η选自0-14中的任意整数，即Rp R2各自独立选择 为氧原子、甲基、乙烷基、丙烷基、丁烷基、戊烷基、己烷基、庚烷基、半烷基、壬烷基、癸烷基、 十一烷基、十二烷基、十三烷基或十四烷基，且该脂肪烃基来自相应卤代烃，优选的脂肪烃 基是癸烷基、十一烷基、十二烷基、十三烷基、和十四烷基；更优选的脂肪烃基是十二烷基； 直线型聚乙烯亚胺的重均分子量为200-5000g/mol ;分支状聚乙烯亚胺的重均分子量为 1250-5000g/mol ;优选的，直线型聚乙烯亚胺的重均分子量为800-4400g/mol，分枝状聚乙 烯亚胺的重均分子量为1250-4400g/mol。
[0012] 本发明的另一方面，提供了一种还原敏感性聚乙烯亚胺衍生物（如上所述）的制备 方法，包括如下步骤：
[0013] (1)将聚乙烯亚胺溶于二氯甲烷和甲醇的混合溶剂中，在30-40°C下搅拌溶解，得 到聚乙烯亚胺溶液；
[0014] (2)将卤代烃溶于二氯甲烷和甲醇的混合溶剂中，以一定速度（10_50ml/h)滴加至 聚乙烯亚胺溶液中，在30-40°C下，避光反应12-48h ;
[0015] (3)将所得混合溶液旋干溶剂得到半固体膏状物，将该半固体膏状物混悬于 5-lOml蒸馏水中，然后用截留分子量为100-1000的透析袋进行透析，冷冻干燥后制得烷基 化疏水修饰的聚乙烯亚胺；
[0016] (4)称取一定量冷冻干燥的聚乙烯亚胺或烷基化疏水修饰的聚乙烯亚胺，溶解 于一定体积的甲醇溶液中，加入一定量的硫化丙烯，在氮气保护条件下60°C，避光反应 24-48h ；
[0017] (5)将所得混合溶液旋干溶剂得到半固体膏状物，加入一定体积DMSO溶解该膏状 物后，室温避光反应48-72h，然后用截留分子量为100-1000的透析袋透析该反应液，透析 介质为去离子水，将透析液体冷冻干澡后，即得到还原敏感性聚乙烯亚胺衍生物；
[0018] 当制备的还原敏感性聚乙烯亚胺衍生物中的R1或R2均选择为氢原子时，则省略烷 基化修饰步骤1-3。
[0019] 步骤（1)中，优选的聚乙烯亚胺与混合溶剂的比例为Ig聚乙烯亚胺溶解于 80-150ml混合溶剂中，二氯甲烷和甲醇混合溶剂的体积比为90:10-99:1 ;
[0020] 步骤（2)中，所述加入脂肪烃基量与聚乙烯亚胺的摩尔比为，0:1-25:1 ;优选是 0:1-20:1 ;更优选是 0:1-15:1 ;最优选是 0:1-12:1。
[0021] 当与卤代烃反应的聚乙烯亚胺为直线型聚乙烯亚胺时，需在反应体系中添加一定 量三乙胺；优选的，Ig直线型聚乙烯亚胺需加入的三乙胺的体积为l-4ml ;
[0022] 用于第（4)步反应的聚乙烯亚胺的pH值需调节为7. 2-7. 4。
[0023] 步骤（4)中，硫化丙烯与聚乙烯亚胺反应的摩尔比为2:1-15:1 ;优选的，硫化丙烯 与聚乙烯亚胺反应的摩尔比为3:1-10:1;更优选的的摩尔比为5:1-8:1。
[0024] 本发明的再一个方面，提供了上述还原敏感性聚乙烯亚胺衍生物作为体内、体外 核酸递送载体的应用。作为体内或体外核酸递送载体时，递送的质粒DNA的大小为l_30Kb ; 优选递送的siRNA的大小为15-30bp。
[0025] 上述作为体内、体外核酸递送载体应用时，还原敏感性聚乙烯亚胺衍生物与核酸 的质量比、脂肪烃基接枝的低分子量聚乙烯亚胺与核酸复合的孵育介质、体外递送时的血 清浓度对转染效率和毒性有显著影响。优选的，脂肪烃基接枝的低分子量聚乙烯亚胺与核 酸的质